自噬在急性肺損傷炎癥中的研究進(jìn)展

瞿利花 陳 超 陳陽曄 李 懿 宋 祁 申 麗

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)可由嚴(yán)重感染、高氧、外傷、藥物、機(jī)械通氣或海水刺激等因素誘發(fā)，主要表現(xiàn)為大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤以及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞屏障功能紊亂，嚴(yán)重時發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[1]。Máca等[2]報道ALI是重癥監(jiān)護(hù)室患者病死率高的重要原因。目前臨床上對ALI的治療主要是藥物如激素類和機(jī)械通氣等手段來改善患者的呼吸困難，近年來研究表明，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬可以減輕ALI，提示自噬可能成為ALI治療的新靶點[3]。

自噬是一種進(jìn)化上保守、動態(tài)的細(xì)胞分解代謝過程，可由溶酶體降解途徑清除受損細(xì)胞器、變性蛋白以及入侵的病原體并釋放能量，對于維持細(xì)胞的正常功能、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用[4]。近年來研究表明，自噬在ALI的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，一方面適度的自噬能抑制炎性因子的釋放；另一方面過度的自噬能加重細(xì)胞損傷。提示對自噬的調(diào)節(jié)可能成為ALI治療的新策略。本綜述介紹了自噬途徑及其分子機(jī)制，以及在ALI模型中的作用。

一、自噬的機(jī)制

自噬是將某些細(xì)胞內(nèi)可溶性大分子或細(xì)胞器等物質(zhì)運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行降解的過程。自噬有3種不同類型，即巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)[5]。巨自噬也稱自噬，需通過形成雙層膜自噬體將物質(zhì)遞送至溶酶體，微自噬通過溶酶體直接攝取物質(zhì)而無自噬體的形成，CMA通過分子伴侶協(xié)助目標(biāo)蛋白直接進(jìn)入溶酶體。在3種自噬中，巨自噬的研究最為廣泛，與ALI的發(fā)生密切相關(guān)。

自噬過程主要包含5個階段：啟動、吞噬泡、自噬體、自噬溶酶體形成以及吞噬物的降解。這些階段主要由自噬相關(guān)蛋白家族(ATGs)調(diào)節(jié)。ATG蛋白按其作用可分為4類：①Atg1/unc-51樣激酶(ULK1)復(fù)合物，包括Ulk1、Atg13、FIP200和Atg101,其作用主要是調(diào)節(jié)自噬啟動；②Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Vps34復(fù)合物，包括PI3K、Vps34、Vps15/P150、Beclin-1/Atg6和Atg14,參與早期自噬體形成；③兩個泛素類似復(fù)合物[Atg16L1-Atg12-Atg5和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)/Atg8]， 參與自噬體的延伸與閉合；④兩種跨膜蛋白Atg9/mAtg9(參與其運(yùn)動的相關(guān)蛋白如Atg18/WIPI-1)和VMP1，有利于膜的傳遞形成自噬體[6]。自噬體形成后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，隨后由溶酶體蛋白水解酶降解被包繞的物質(zhì)，生成的小分子物質(zhì)回到細(xì)胞質(zhì)中重新利用。

二、在ALI中自噬對不同細(xì)胞的作用

大量研究結(jié)果表明自噬在ALI的炎癥發(fā)生、發(fā)展以及發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，但其調(diào)控ALI炎癥的最終結(jié)果與不同的細(xì)胞類型有關(guān)。

1.巨噬細(xì)胞:巨噬細(xì)胞通常存在于肺間質(zhì)和肺泡中，是在感染等損傷時啟動肺部炎癥的重要細(xì)胞。當(dāng)發(fā)生炎癥時更多的巨噬細(xì)胞聚集到肺部維持和加重炎癥損傷。研究發(fā)現(xiàn)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中巨噬細(xì)胞自噬能抑制炎性反應(yīng)，而自噬缺陷小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)大量異常線粒體聚集，進(jìn)一步激活NALP3炎性體和線粒體活性氧(ROS)誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，同時觀察到小鼠死亡率增加[7]。Harris等[8]發(fā)現(xiàn)用Toll樣受體配體處理巨噬細(xì)胞后，促炎性因子能結(jié)合到自噬體上，而用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin, RAPA)能使促炎性因子降解同時抑制炎性因子分泌。在研究盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)誘發(fā)的小鼠模型中，自噬基因Beclin1敲除可增加CLP后患敗血癥的概率，而CO增強(qiáng)小鼠體內(nèi)以及巨噬細(xì)胞中Beclin1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬作用[9]。

2.中性粒細(xì)胞：在ALI早期階段中性粒細(xì)胞大量產(chǎn)生，釋放顆粒內(nèi)容物和促炎細(xì)胞因子。Zhu等[10]的研究表明在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI中，中性粒細(xì)胞的自噬為中性粒細(xì)胞的活化及顆粒內(nèi)容物的釋放所必須的；在ALI期間中性粒細(xì)胞自噬增加，導(dǎo)致顆粒內(nèi)容物釋放增加；故通過抑制中性粒細(xì)胞自噬，敲低自噬基因Atg5消除了LPS和fMLP對中性粒細(xì)胞釋放MPO的作用，限制顆粒內(nèi)容物的釋放，從而減輕ALI。而RAPA預(yù)處理顯著抑制粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化和激活，抑制肺中性粒細(xì)胞積聚，減少支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子的水平，減輕了肺損傷。

3.肺泡上皮細(xì)胞：肺泡上皮細(xì)胞有Ⅰ型和Ⅱ型兩類。上皮的破壞導(dǎo)致上皮通透性增高及液體轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙。目前自噬在上皮細(xì)胞的研究多數(shù)顯示過度的自噬能使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)可減少納米顆粒誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞死亡并改善小鼠ALI。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因Beclin1敲除或自噬抑制劑3-MA來抑制H5N1感染引起的肺上皮細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡，從而緩解了ALI，降低小鼠死亡率[11]。

自噬與高氧、香煙煙霧誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞死亡有關(guān)。在高氧誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(Beas-2B)中，LC3B-siRNA促進(jìn)高氧誘導(dǎo)的Beas-2B死亡，而LC3B的過表達(dá)對細(xì)胞起保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)這種保護(hù)作用與LC3B 調(diào)節(jié)高氧下細(xì)胞凋亡信號基因Fas 有關(guān)[12]。一氧化碳(CO)對高氧刺激起保護(hù)，并抑制高氧相關(guān)的ROS產(chǎn)生，而LC3B-siRNA減弱CO對高氧誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞死亡的保護(hù)作用[13]。然而，研究發(fā)現(xiàn)在支氣管上皮細(xì)胞中，使用LC3B-siRNA能阻斷自噬，減弱了香煙煙霧誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和凋亡。

4.肺血管內(nèi)皮細(xì)胞:肺血管內(nèi)皮細(xì)胞參與構(gòu)成呼吸膜，對于維持肺泡腔的干燥發(fā)揮重要的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷引起毛細(xì)血管通透性增高，是炎癥滲出的重要環(huán)節(jié)[14]。自噬對于血管內(nèi)皮細(xì)胞正常功能的維持發(fā)揮重要作用。Ma等[15]發(fā)現(xiàn)高氧增加自噬蛋白LC3B的表達(dá)，引起肺內(nèi)皮細(xì)胞線粒體分裂，加重肺損傷。在缺氧條件下引起肺動脈高壓，敲低自噬基因LC3B小鼠出現(xiàn)大量肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞受損以及肺動脈高壓加重。自噬可以調(diào)節(jié)肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和過度增殖從而在肺血管重構(gòu)中起重要作用。用ssAtg101-TNP形成的納米顆粒來敲低肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬基因Atg101表達(dá)，抑制細(xì)胞自噬，在缺氧刺激下促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞通透性增加，而增加自噬逆轉(zhuǎn)了這些現(xiàn)象，提示自噬的調(diào)節(jié)可能成為內(nèi)皮損傷有關(guān)疾病治療的新策略[16]。然而，Slavin等[17]研究表明,用自噬抑制劑3-MA或敲低自噬基因Atg5可以減輕LPS誘導(dǎo)的肺損傷模型中肺內(nèi)皮細(xì)胞屏障破壞以及炎性反應(yīng)，從而減輕了ALI。

三、自噬與ALI炎性介質(zhì)

ALI發(fā)生過程中炎性細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集和激活可以產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，根據(jù)其在炎性反應(yīng)中的作用，這些細(xì)胞因子可以分為促炎和抗炎兩類。促炎細(xì)胞因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等；抗炎因子包括IL-4、IL-10和IL-13等。這些細(xì)胞因子能與自噬相互調(diào)節(jié)，從而影響炎性反應(yīng)的過程。

1.細(xì)胞因子調(diào)節(jié)自噬：ALI中，炎性反應(yīng)的過程與多種細(xì)胞因子有關(guān)。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子對自噬蛋白調(diào)節(jié)起重要作用。研究表明Th1細(xì)胞因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6和TGF-β為促炎因子，具有誘導(dǎo)自噬作用；而Th2細(xì)胞因子為抗炎因子，包括IL-4、IL-10和IL-13，具有抑制自噬作用[18]。用IFN-γ激活巨噬細(xì)胞通過Irgm1/IRGM依賴性方式引起分枝桿菌的吞噬體和自噬增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)病原體減少。用TNF阻斷劑可以解除IFN-γ誘導(dǎo)的吞噬體的成熟，這表明IFN-γ誘導(dǎo)的吞噬體成熟和自噬可能依賴TNF-α。研究表明，在不同細(xì)胞中TNF-α可以通過不同的機(jī)制刺激細(xì)胞自噬，發(fā)揮不同的作用[19]。例如，在血管平滑肌細(xì)胞中TNF-α可以通過激活Jun激酶信號通路以及抑制Akt活化來上調(diào)自噬基因LC3和Beclin1的表達(dá)[20]。在乳腺癌細(xì)胞中TNF-α通過ERK1/2途徑誘導(dǎo)自噬，而NF-κB的激活可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的自噬，這依賴于ROS的產(chǎn)生。IL-6和 IL-1被證明都可以刺激自噬[21，22]。

研究表明，在饑餓或炎癥刺激誘導(dǎo)下Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-13和IL-10通過不同途徑抑制自噬，饑餓引起的自噬抑制依賴于Akt途徑，RAPA誘導(dǎo)的自噬依賴于STAT信號通路。另外，其他相關(guān)的細(xì)胞因子，如生長因子和趨化因子也參與自噬的調(diào)節(jié)。Ding等研究已表明TGF-β可增加自噬基因Atg7和Atg5的表達(dá)并誘導(dǎo)自噬體形成。趨化因子CCL2(單核細(xì)胞趨化蛋白-1)能刺激自噬和上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)。

2.自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞因子：自噬可影響細(xì)胞因子的分泌。自噬可能通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)IL-1β分泌。巨噬細(xì)胞的自噬缺失或Atg7、Atg16L1、Beclin1自噬基因敲低以及用自噬抑制劑3-MA處理，在TLR激動劑下能刺激IL-1β分泌，這種影響可能依賴于含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭誘導(dǎo)IFN-β(TRIF)、線粒體ROS以及線粒體DNA，也可能與NLRP3有關(guān)，或不依賴于TRIF，而是依賴于p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。RAPA誘導(dǎo)自噬可抑制樹突狀細(xì)胞IL-1β分泌，由于IL-1α和IL-1β都能誘導(dǎo)自噬，這可能作為負(fù)反饋機(jī)制來控制IL-1參與的炎性反應(yīng)。此外，IL-18、IL-6和TNF-α的分泌也受自噬的調(diào)節(jié)。自噬的抑制增強(qiáng)了IL-18的分泌，但可減少IL-6、IL-8和TNF-α的分泌[8]。

四、自噬在不同模型中的作用

研究不斷發(fā)現(xiàn)，自噬與人類疾病存在密切關(guān)系。一些研究已揭示了自噬與肺部炎癥性疾病(如免疫性肺炎、肺結(jié)核、肺癌、ALI等)的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。近幾年自噬在ALI動物模型的研究越來越多，例如細(xì)菌感染、膿毒癥、海水等因素引起的ALI模型，詳細(xì)的細(xì)胞分子機(jī)制尚未闡明。這些研究大多數(shù)使用自噬激活劑如RAPA和自噬抑制劑如3-MA，來激活或阻斷自噬，然后觀察ALI的變化。

在LPS誘導(dǎo)的ALI中，LPS引起的過度自噬是ALI發(fā)生的主要原因，用3-MA處理能抑制TLR4-NF-κB通路、自噬蛋白的表達(dá)，減輕ALI[3]。而飽和氫鹽水能下調(diào)NF-κB的表達(dá)，引起B(yǎng)eclin1轉(zhuǎn)錄減少抑制自噬，從而達(dá)到治療ALI的作用[24]。也有報道發(fā)現(xiàn)在ALI小鼠中提高自噬能激活SIRT/MAPK信號通路顯著減輕了肺水腫和炎性細(xì)胞浸潤[25]。可見，自噬在LPS誘導(dǎo)的ALI中的作用還遠(yuǎn)未闡明。

CLP誘導(dǎo)的小鼠ALI中，LC3-II、Atg5表達(dá)下調(diào)自噬受到抑制，用RAPA激活肺組織自噬，抑制了白細(xì)胞浸潤、促炎反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[26]。與此結(jié)果一致的是，過表達(dá)LC3的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出自噬體的清除增加，中性粒細(xì)胞積聚減少，減輕ALI從而顯著提高生存率[27]。在海水誘導(dǎo)的ALI模型過程中，自噬抑制劑3-MA能減少肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8的表達(dá)并一定程度減輕了肺損傷[28]。在機(jī)械通氣誘導(dǎo)的肺損傷(VILI)中的作用。López等[29]研究表明VILI能誘導(dǎo)自噬，而在自噬基因Atg4b敲除的小鼠NF-κB激活受抑制機(jī)械通氣引起的炎性反應(yīng)改善，減輕肺損傷。

五、展 望

自噬在ALI中具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于自噬在ALI中的作用研究取得了一定的進(jìn)展，自噬的分子機(jī)制、途徑與ALI關(guān)系需進(jìn)一步探索。由于生物化學(xué)途徑的相互影響、廣泛聯(lián)系和復(fù)雜多變，將有關(guān)自噬的基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為應(yīng)用還需漫長的探索。從治療角度來看，自噬的調(diào)節(jié)對ALI具有潛在的治療價值。由于自噬的功能可能與細(xì)胞類型而異，在不同條件下對患者使用自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑可能會產(chǎn)生不同的作用。癥狀改善或惡化可能會難以預(yù)測。從診斷的角度來看，自噬的標(biāo)記蛋白LC3B在細(xì)胞凋亡開始之前增加，提示可用作一些ALI的早期生物標(biāo)志物。今后的研究將集中于自噬詳細(xì)機(jī)制及途徑在ALI中的作用，從而為進(jìn)一步改善ALI策略奠定基礎(chǔ)。