川崎病內(nèi)皮細(xì)胞模型及其發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展

鄭小蘭 張 怡

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種以全身中小動(dòng)脈血管炎為主要病變的急性發(fā)熱出疹性疾病，主要發(fā)生于6個(gè)月～5歲兒童。自1967年川崎富作首次報(bào)道以來，全世界均有報(bào)道，近年來其發(fā)生率呈逐年升高趨勢[1]。KD可并發(fā)冠狀動(dòng)脈損傷(coronary artery lesion，CAL)，目前已是發(fā)達(dá)國家兒童獲得性心臟病的首要發(fā)病原因[2]。既往研究認(rèn)為CAL始于血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控紊亂[3]。因此，建立合適的KD內(nèi)皮細(xì)胞系模型，是探索KD及其CAL發(fā)病機(jī)制、預(yù)防及治療的重要基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外已建立的KD內(nèi)皮細(xì)胞模型主要有人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)與人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human coronary artery endothelial cells，HCAEC)。本文系統(tǒng)介紹了KD體外研究的內(nèi)皮細(xì)胞模型及其在發(fā)病機(jī)制上的研究進(jìn)展。

一、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

自Jaffe等1973年首次培養(yǎng)了HUVEC以來，HUVEC就廣泛用于血管內(nèi)皮細(xì)胞病變的研究[4]。Jiang等[5]發(fā)現(xiàn)KD患兒血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平明顯升高，TNF-α能同時(shí)誘導(dǎo)HUVEC凋亡并抑制其擴(kuò)散，是一種重要炎性因子。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，生物學(xué)活性廣泛，可參與調(diào)節(jié)免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞、介導(dǎo)炎性反應(yīng)及組織損傷等病理生理過程[6]。Inoue等[7]分別用急性期與恢復(fù)期KD患兒血清孵育HUVEC，發(fā)現(xiàn)急性期KD血清刺激HUVEC后其TNF-α水平升高，且細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)增加，表明KD分泌TNF-α可誘導(dǎo)ICAM-1表達(dá)，參與KD發(fā)生、發(fā)展。Kaneko等[8]以TNF-α處理后的HUVEC為炎性內(nèi)皮細(xì)胞模型，使用重組表達(dá)cDNA克隆的血清學(xué)分析技術(shù)，對4個(gè)恢復(fù)期KD患兒血清進(jìn)行免疫篩選鑒定了46個(gè)抗原，這些抗原在5個(gè)非KD患兒血清中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)，為了解KD發(fā)病機(jī)制提供了線索。

microRNA(miRNA)為長度約22nt的內(nèi)源性短鏈單鏈RNA分子，屬于非編碼RNA，既往認(rèn)為非編碼RNA沒有生物學(xué)功能，近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA可通過與編碼蛋白質(zhì)mRNA互補(bǔ)結(jié)合，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等一系列過程，在血管生成和病變以及心血管疾病等過程中可發(fā)揮重要作用[9]。2013年Shimizu等[10]首次用小RNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)miRNA-145可能參與調(diào)控KD急性期的轉(zhuǎn)化生長因子-β通路調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，提示了miRNA可能在KD發(fā)病過程中發(fā)揮作用。Ni等[11]研究發(fā)現(xiàn)，急性期KD中miR-155/SOCS1信號通路的激活和miR-31表達(dá)水平的升高，可能導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞下降，進(jìn)而致免疫系統(tǒng)功能紊亂。He等[12]用 KD患兒血清刺激HUVEC后，發(fā)現(xiàn)HUVEC表達(dá)的miR-483降低，結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothlial-mesenchymal transition，EndoMT)標(biāo)記增加。分析發(fā)現(xiàn)miR-483可被Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)激活，KD血清可抑制KLF4-miR-483軸，導(dǎo)致CTGF表達(dá)增加、EndoMT水平升高，最終引起CAL；他汀類藥物可恢復(fù)KLF4-miR-483軸的表達(dá)，可能對急性KD患兒起到一定的治療作用。Wu等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-186在急性KD患兒血清中上調(diào)，影響SMAD6的表達(dá)，調(diào)節(jié)TGF-β/MAPK信號通路，誘導(dǎo)了HUVEC損傷，提示miR-186可作為KD藥物治療靶點(diǎn)。近年來，KD血清中各種具有不同作用的miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，已成為KD研究的熱點(diǎn)和前沿，表明miRNA在KD生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)研究方面有重要價(jià)值。

內(nèi)皮微粒(endothelial microparticle，EMP)是血管內(nèi)皮細(xì)胞在激活或凋亡狀態(tài)下所釋放的微小囊泡狀物質(zhì)，直徑約0.1～1.0μm。EMP為一種用于交換生物信號的細(xì)胞間的傳遞系統(tǒng)，在炎癥、凝血和血管功能調(diào)節(jié)方面均有一定作用，被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞受損的標(biāo)志，其測定已被認(rèn)為是評價(jià)內(nèi)皮損傷的方法[14]。Nakaoka等[15]用流式細(xì)胞儀檢測到KD急性期患兒血清中EMP明顯升高，且并發(fā)CAL的患兒EMP比無CAL的患兒升高更明顯，經(jīng)過初始IVIG治療后EMP明顯下降，用miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)特殊miRNA，hsa-miR-145-5p和hsa-miR-320a封裝于EMP中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)miRNA雜交信號可以在CAL患兒內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到，提示miRNA可被封裝于EMP，然后從內(nèi)皮細(xì)胞釋放入管腔中，表明EMP定量分析有成為KD生物標(biāo)志物的潛在可能性。Tian等[16]用TNF-α刺激HUVEC后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞上清液發(fā)現(xiàn)EMP水平明顯升高，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，并分泌大量微粒子；由于既往研究已證實(shí)TNF-α參與了KD發(fā)病，故可認(rèn)為EMP在KD血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中可能起著重要作用[8]。

由于HUVEC具有分化潛能和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞特性，可通過新生兒臍帶消化所得，獲取容易，所以目前對內(nèi)皮細(xì)胞功能的了解大部分是基于HUVEC的研究[17]。但HUVEC平均壽命為傳代10次，可培養(yǎng)約5個(gè)月，故用HUVEC做長期體外實(shí)驗(yàn)是不可能的[18]。由于供者來源不同，故分離培養(yǎng)的HUVEC所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互之間并沒有可比性。McCall等[19]對人不同類型的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行miRNA分析后發(fā)現(xiàn)不同類型內(nèi)皮細(xì)胞miRNA表達(dá)不一致。KD患兒心血管并發(fā)癥主要發(fā)生在冠狀動(dòng)脈，與HUVEC在基因表達(dá)、血流動(dòng)力學(xué)、功能等方面存在差異，故基于HUVEC研究的KD實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍存在爭議，但Krishnaswamy等[20]用RT-PCR檢測TNF-α刺激HCAEC和HUVEC后分泌的細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)沒有明顯差別，提示目前基于HUVEC進(jìn)行的KD體外研究仍具有非常重要的意義，值得進(jìn)一步研究。

二、人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

HCAEC對研究和了解冠狀動(dòng)脈疾病的分子機(jī)制有重要價(jià)值，Krishnaswamy等[20]首次報(bào)道了HCAEC多功能性細(xì)胞因子的表達(dá)，及其在炎性因子和糖皮質(zhì)激素調(diào)控下的變化，比較了來自HCAEC和HUVEC的細(xì)胞系中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HCAEC中白細(xì)胞介素-5(interleukin-5，IL-5)、IL-6、IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達(dá)上調(diào)；TNF-α刺激HCAEC后能誘導(dǎo)其表達(dá)IL-1α、IL-6、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和MCP-1；HCAEC與HUVEC表達(dá)的細(xì)胞因子的基因分布沒有明顯的差異，糖皮質(zhì)激素能抑制這兩種細(xì)胞表達(dá)IL-8。這些研究表明HCAEC能夠表達(dá)多種多功能的細(xì)胞因子，可能與血管炎癥有關(guān)。有研究者[21]提取KD患兒外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其上清液TNF-α含量明顯高于非KD患兒組，用此上清液刺激HCACE后發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-1β、NF-κB p65及半胱天冬酶-6表達(dá)上調(diào)，且可誘導(dǎo)HCAEC細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑可明顯減輕上述反應(yīng)，提示KD患兒血管炎的發(fā)病機(jī)制與NF-κB信號通路有關(guān)，這與以HUVEC為模型進(jìn)行的研究結(jié)論相符[22]。

維生素D是一種固醇類衍生物及類固醇激素，也是人體必需的脂溶性維生素，其在血液中的最強(qiáng)活性形式為1,25二羥維生素D[1,25-(OH)2D3]，多項(xiàng)研究表明維生素D缺乏與心血管疾病發(fā)生有潛在相關(guān)性[23]。Kudo等[24]用1,25-(OH)2D3預(yù)處理HCAEC，可抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)表達(dá)和IL-8產(chǎn)生，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。Suzuki等[25]用1,25-(OH)2D3預(yù)處理HCAEC，發(fā)現(xiàn)1,25-(OH)2D3可抑制TNF-α誘導(dǎo)NF-κB活化和E選擇素分泌，調(diào)節(jié)KD血管炎性反應(yīng)，提示維生素D可能有治療KD血管炎癥的潛在價(jià)值。

由于制備HCAEC所需的冠狀動(dòng)脈標(biāo)本獲取困難，故目前絕大多數(shù)研究所用細(xì)胞是直接向生物公司購買所得。田鳳石等[26]在成年男性猝死半小時(shí)內(nèi)的心臟里提取HCAEC，在國內(nèi)首先建立了成人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。由于KD發(fā)病主要為5歲以下兒童，成人冠狀動(dòng)脈與兒童冠狀動(dòng)脈存在差異，若能以相似方法得到KD患兒的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞并將其用于KD研究，則會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更有價(jià)值；但不可否認(rèn)的是，目前基于HCAEC的KD研究仍具有重要意義。

三、其 他

目前KD研究的體外模型所使用的內(nèi)皮細(xì)胞以HUVEC與HCAEC為主。研究者仍在不斷探索新的內(nèi)皮細(xì)胞模型，Donnini等[27]首次建立了一種新型人類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cells，HAEC)增殖的長期培養(yǎng)系統(tǒng)。此類HAEC可在體外保持多代不同的分化特征，產(chǎn)生抗血栓因子和血栓形成因子，并對TNF-α刺激產(chǎn)生炎性反應(yīng)，在表面表達(dá)ICAM-1，產(chǎn)生大量NO、ET和細(xì)胞因子，從而改變生長特性，此新系統(tǒng)可能對理解和研究許多血管病變的分子機(jī)制和老化過程非常有用。KD并發(fā)癥以冠狀動(dòng)脈為主，而主動(dòng)脈造并未受到明顯損傷，提示將HAEC模型用于KD發(fā)病機(jī)制的比較研究有重要價(jià)值。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)是一種由自身體細(xì)胞通過去分化、重編程后誘導(dǎo)出的類胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞，較普通成體干細(xì)胞有更高的全能性。自2006年日本科學(xué)家山中伸彌利用Oct3/4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4種轉(zhuǎn)錄因子成功誘導(dǎo)出iPSC以來，iPSC技術(shù)不斷發(fā)展。2017年Ikeda等[28]分別將IVIG抵抗型與IVIG反應(yīng)型KD患兒的皮膚成纖維細(xì)胞通過基因技術(shù)誘導(dǎo)出iPSC，并使其分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(iPSC-ECs)；對iPSC-ECs進(jìn)行RNA測序后發(fā)現(xiàn)，CXCL12表達(dá)在源自IVIG抵抗型患兒的iPSC-ECs中明顯上調(diào)，參與IL-6信號的基因組表達(dá)上調(diào)，提示這些基因與KD發(fā)病相關(guān)，此研究是研究者首次建立iPSC模型對KD進(jìn)行體外研究，為后續(xù)研究提供了新思路，但iPSC的誘導(dǎo)率低、有癌變、技術(shù)尚不成熟等都是需要解決的問題。

綜上所述，KD自發(fā)現(xiàn)以來，眾多研究對本病進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)室研究和臨床觀察，KD發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，但越來越多基于內(nèi)皮細(xì)胞模型的KD體外研究為其發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。目前用于KD研究的內(nèi)皮細(xì)胞模型都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，隨著科技進(jìn)步，特別是iPSC技術(shù)的發(fā)展，有望克服當(dāng)前困難，建立一種新的KD體外研究的內(nèi)皮細(xì)胞模型，但需要強(qiáng)調(diào)的是，目前實(shí)驗(yàn)常用的HUVEC與HCAEC模型仍具有不可替代的價(jià)值。