非編碼RNA在膽管惡性腫瘤的研究進展

胡 晟 鄒 浩 周 磊 邱嵐茜 張小文

膽管惡性腫瘤(biliary tract cancers, BTCs)預(yù)后較差，其特點是早期侵犯淋巴結(jié)和全身轉(zhuǎn)移[1]。這類疾病包括膽囊癌(gallbladder cancer, GBC)和膽管癌(cholangiocarcinoma, CCA)，分為肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)和肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma, eCCA)。目前，手術(shù)切除仍是治療BTCs的主要方法，輔助性放化療并不是這些惡性腫瘤的首選。此外，在行根治性手術(shù)后許多患者仍會復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性BTCs患者的預(yù)后通常較差。因此，有必要對BTCs潛在生物學(xué)標志物進行進一步的研究，以便對BTCs行早期診斷、進行綜合性治療及判斷患者預(yù)后。最近的研究已經(jīng)將微RNA(microRNA，miRNA)描述為某些惡性腫瘤的潛在生物學(xué)標志物。然而，miRNA的表達及其如何對BTCs的診斷、預(yù)后和治療產(chǎn)生影響的機制尚未清楚。雖然miRNA是一種非編碼小RNA(19～23個核苷酸)，但其在調(diào)控大量重要的生物學(xué)功能方面發(fā)揮了重要作用，研究miRNA有利于BTCs的診斷、預(yù)后和治療。miRNA通過與mRNA3′非編碼區(qū)(3′UTRs)的結(jié)合調(diào)控并表達特異的靶基因，這些表達對于不同類型的惡性腫瘤的疾病發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，包括腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲。

一、miRNA的調(diào)控機制及其靶向基因

目前有關(guān)miRNA生物起源和成熟的研究模型表明，該過程首先在細胞核中進行，然后在細胞質(zhì)中進行[2]。miRNA的生物起源的最關(guān)鍵一步是miRNA的前體pri-miRNA的形成,通常由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成，其長度一般為幾千個核苷酸[3]。盡管如此，pri-miRNA通常包含4個尿嘧啶，其轉(zhuǎn)錄過程將被轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ終止。由核糖核酸酶Ⅲ催化，促使pre-miRNA分裂，形成了由70個核苷酸左右組成的前體miRNA(pre-miRNA)。由于雙鏈RNA結(jié)合域(dsRBD)和狄喬治氏相關(guān)蛋白8抗體(DGCR8)蛋白的作用，所以pri-miRNA轉(zhuǎn)化為pre-miRNA的過程是高效的。隨后，pre-miRNA通過結(jié)合一個稱為輸出蛋白5的核出口因子，將前miRNA運輸?shù)郊毎|(zhì)中，并在Dicer酶的催化下形成成熟的雙鏈miRNA[4]。該成熟miRNA的功能鏈主要參與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)的形成，它通過降解相應(yīng)的mRNA或抑制編碼蛋白的合成，對靶基因的表達產(chǎn)生負性作用。通過miRNA和mRNA的靶向基因3UTR近乎完美的堿基互補，轉(zhuǎn)錄后的基因可以保持沉默[5]。

盡管miRNA的生物起源已越來越確定，但其潛在的調(diào)控機制仍然不太清楚[6]。大量的研究證據(jù)表明，miRNA表達的調(diào)控機制包括轉(zhuǎn)錄解控、表觀遺傳學(xué)改變、突變、DNA復(fù)制異常以及miRNA在其生物起源中存在的缺陷，這些機制可能與人類癌癥中miRNA的解控機制密切相關(guān)[7]。此外，研究的重點是miRNA表達的表觀遺傳學(xué)改變和甲基化和組蛋白修飾對miRNA的表達，這兩者都是表觀遺傳基因調(diào)控的標志[8]。例如,在膽管癌(cholangiocarcinoma, CCA)細胞中，miR-370作為一種抑癌基因可抑制原癌基因的致敏蛋白激酶8 (MAP3K8)[9]。此外，白介素-6 (IL-6)過表達CCA通過DNA超甲基化降低miR-370表達，同時恢復(fù)MAP3K8表達，這有助于腫瘤細胞生長，促進CCA的進展。另一項研究表明，miR-370的免疫球蛋白-二甲基甲酰胺(IG-DMR)表達反應(yīng)了IL-6在人類CCA誘導(dǎo)的高甲基化調(diào)控[10]。

據(jù)報道，幾種轉(zhuǎn)錄因子通過與miRNA的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，促進miRNA的轉(zhuǎn)錄進而促進miRNA的表達。例如，螺旋-環(huán)-螺旋型亮氨酸的轉(zhuǎn)錄因子(c-Myc)的表達增加，可以直接結(jié)合miR-17的調(diào)控區(qū)域來促進miRNA的表達[11]。miRNA的上調(diào)可能是由于擴增、轉(zhuǎn)錄因子的失調(diào)和CpG島在人類癌癥特異性miRNA基因啟動子區(qū)域的脫甲基作用。此外，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)普遍存在于miRNA基因中，可以調(diào)節(jié)miRNA的數(shù)量使其具有多種功能，這可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系[12]。

miRNA可以作為腫瘤致癌基因或抑癌基因，這在很大程度上取決于其靶基因的作用。一個miRNA可以調(diào)節(jié)許多不同的靶mRNA，相反地，幾個不同的miRNA可以對一個目標mRNA進行聯(lián)合調(diào)控。因此，miRNA及其靶向基因?qū)⑿纬蓮?fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在癌癥中上調(diào)的miRNA可作為腫瘤致癌基因，通過抑制抑癌基因的表達和抑制參與細胞增殖或凋亡的基因來促進癌癥的發(fā)生，而下調(diào)的miRNA可作為腫瘤抑癌基因從而抑制癌癥的發(fā)生。最近，越來越多的研究者對癌癥潛在的基因變異進行了深入研究，例如癌基因和抑癌基因在人類BTCs發(fā)病機制中的作用[13]。

二、miRNA在膽管惡性腫瘤中的作用及臨床意義

根據(jù)目標mRNA的作用，大量解控的miRNA被歸類為原癌基因miRNA和抑癌基因miRNA。在BTCs中，研究較為透徹的miRNA是hsa-miR-21，它通常被認為是一種原癌基因miRNA，因為它的過表達與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。Liu等[15]觀察到hsa-miR-21在過表達后可顯著促進腫瘤細胞遷移、侵襲并能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為CCA細胞系(QBC939和RBE)。此外，在hsa-miR-21過表達后可表現(xiàn)出E-cadherin表達減少、N-cadherin和波形蛋白表達增加。因此，hsa-miR-21可誘導(dǎo)CCA的上皮細胞間質(zhì)化(EMT)。在這一過程中，上皮細胞失去了細胞極性和細胞黏附功能，這可能是由于E-cadherin表達的減少，使得細胞可以遷移和侵襲周圍組織；E-cadherin表達減少或缺失在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵的作用。

相似的，miRNA的異常表達同樣能誘導(dǎo)EMT并增強GBC細胞的遷移能力。Bao等[16]報道hsa-miR-101過表達可抑制GBC細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)E-cadherin和β-catenin的表達增加，并導(dǎo)致波形蛋白表達減少。此外，研究者發(fā)現(xiàn)hsa-miR-101的下調(diào)與腫瘤直徑、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及GBC患者的生存率低有關(guān)。這些結(jié)果表明，hsa-miR-101在GBC中發(fā)揮了抑癌基因作用，減弱了EMT和細胞轉(zhuǎn)移。

越來越多的研究表明hsa-miR-146b-5p具有重要的抑癌作用[17]。與鄰近的非腫瘤組織相比，GBC組織的hsa-miR-146b-5p基因表達明顯下調(diào)。此外，SGC-996 GBC細胞系中hsa-miR-146b-5p的過表達可抑制細胞的生長、加速細胞凋亡、抑制G1期細胞生長。然而，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)作為一種結(jié)合表皮生長因子(可誘導(dǎo)細胞增殖)的細胞表皮蛋白，其過量表達可逆轉(zhuǎn)hsa-miR-146b-5p抑制細胞增殖的能力。此外，hsa-miR-146b-5p的表達水平與腫瘤的直徑和腫瘤的進展有顯著的相關(guān)性[18]。

最近的研究已經(jīng)將hsa-miR-135a-5p描述為具有抑癌作用的一類基因[19]。在GBC中，Zhou等[20]發(fā)現(xiàn)，與鄰近的非腫瘤膽囊組織相比，hsa-miR-135a-5p在腫瘤組織中的表達明顯下調(diào)，特別是在Ⅲ級和Ⅳ級腫瘤中。hsa-miR-135a-5p抑制GBC細胞在G1/S期的增殖和復(fù)制能力，這些研究提示hsa-miR-135a-5p可能抑制GBC細胞的增殖。

三、miRNAs作為膽管惡性腫瘤的生物學(xué)標志物

在CCA患者血清中miRNA-106a表達明顯降低，與良性膽管疾病(benign biliary tract disease，BBD)和健康人群相比差異明顯，miRNA-106a下調(diào)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不佳密切相關(guān)。值得注意的是，miRNA-106a的血清表達水平逐漸下降，在健康個體中表達最高，在BBD患者中表達中等，在CCA患者中表達最低。

Meng等[21]描述了一種可作為膽管癌生物學(xué)標志物的miRNA，他們發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-200b與吉西他濱的敏感度或耐藥性有關(guān)。目前已有各種文獻報道了循環(huán)miRNA在BTCs中診斷和預(yù)后潛在的臨床價值，大多數(shù)miRNA在CCA中表達，而在GBC和壺腹腺癌中表達較少。Li等[22]分析了GBC患者循環(huán)miRNA的表達，發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-187和miR-202上調(diào);相比之下，在GBC患者和健康對照組(P<0.05)之間，miR-143和miR-335下調(diào)(P<0.05)，在組織和血液樣本中出現(xiàn)一致的表達。此外, 3種miRNA(miR-187、miR-143、miR-202)和淋巴轉(zhuǎn)移的差異表達之間存在顯著的關(guān)系，miR-21的過表達更與TNM分期的進程密切相關(guān)，這意味著臨床醫(yī)師可以聯(lián)合利用CA19-9和miR-21來鑒別診斷BTCs和健康人群。術(shù)后循環(huán)miR-21表達下降。此外，miR-21在人的CCA組織和細胞系中均呈過度表達，其敏感度和特異性分別為95%和100%，足以區(qū)分CCA與正常組織[23]。

Plieskatt等[24]對iCCA腫瘤組織中的miRNA表達水平進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)8個miRNA(miR-483-5p、miR-505-3p、miR-874、miR-885-5p、miR-320b、miR-92b-3p、miR-1275和miR-1307-3p)的表達僅在iCCA患者血漿樣本中檢測出，而未在對照組血漿中檢測出。此外，腫瘤組織中異常的miRNA表達與在血漿中觀察到的不相符，其中有15個高度管制的miRNA僅在腫瘤組織樣本中檢測到。故血漿中的這個表達譜可以作為早期診斷iCCA的生物學(xué)標志物。Wang等[25]研究了miRNA在腫瘤組織和對照血漿樣本中的表達，發(fā)現(xiàn)miR-150表達顯著，在ICC血漿患者中上調(diào)，在腫瘤組織中觀察到在組織中下調(diào)的相反結(jié)果。miR-150表達水平與患者年齡、性別和腫瘤分期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Huang等發(fā)現(xiàn)miR-224在血清中明顯上調(diào)，與健康對照組相比CCA患者腫瘤組織中miR-224也有明顯地上調(diào)。此外，以miR-224干預(yù)人類CCA細胞系可增強細胞生長、侵襲性和遷移能力。Kojima等研究了大量的BTCs和胃腸道腫瘤病例，他們發(fā)現(xiàn)，66個miRNA在測試隊列中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中30個miRNA被上調(diào)，36個miRNA在BTCs中下調(diào)。在BTCs和健康組的比較中，miR-125a-3p和miR-6893-5p的表達表現(xiàn)出最小的P值。同時，Que等對壺腹癌(ampullary carcinoma,AC)中部分循環(huán)miRNA的表達進行了評價，選取了與胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PA)相關(guān)的4個miRNA(miR-17-5p、miR-21、miR-155和miR-196a)，以評價血清體外miRNA水平。PA患者與AC患者的miR-21和miR-17-5p的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，此外這些miRNA在AC中的表達往往高于健康對照組。根據(jù)這些結(jié)果，所選的miRNA對胰腺癌和BTCs比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

Cheng等的另一項研究發(fā)現(xiàn)，與BBD患者或健康對照組相比，CCA患者的循環(huán)miR-106a下調(diào)。此外，CCA患者血清miR-21表達水平高于BBD對照組。利用血清miR-106a的曲線面積(area under the curve,AUC)從健康對照組區(qū)分CCA患者為0.89;該標記的敏感度和特異性分別為81.6%和85.0%。這一結(jié)果的敏感度和特異性比血清CA19-9要高。與此同時，血清樣本中miR-106a的下調(diào)與CCA患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不佳有關(guān)。

四、展 望

miRNA具有巨大的科學(xué)和臨床意義，目前越來越清楚地認識到這種非編碼RNA是導(dǎo)致惡性腫瘤的一個主要因素。miRNA不僅提示了作為BTCs新的治療靶點，并且利于我們更多地了解導(dǎo)致BTCs細胞癌變的病理過程。miRNA通過直接轉(zhuǎn)錄抑制已知的腫瘤抑制基因，直接促進腫瘤細胞的增殖和侵襲性，是一種強有力的致癌基因。miRNA不僅能在細胞增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮重要的作用，而且還能作為癌基因、腫瘤抑制物、新生物學(xué)標志物在診斷和預(yù)后中發(fā)揮作用，以及在BTCs中作為化療耐藥的增強劑。此外，miR-21、miR-187、miR-143和miR-202的表達與腫瘤進展和淋巴轉(zhuǎn)移之間存在顯著的關(guān)系。綜上所述，這些研究反映出miRNA可作為臨床應(yīng)用的潛在生物學(xué)標志物，用于BTCs的早期診斷及判斷其預(yù)后。因此利用miRNA作為早期診斷性生物學(xué)標志物可能是改善BTCs患者預(yù)后的一個有效手段。然而，迄今為止很少有研究明確指出在miRNA在BTCs患者中的意義。故目前仍需要更多研究數(shù)據(jù)來確定哪些miRNA可作為BTCs的潛在治療靶點或診斷和預(yù)后生物學(xué)標志物，所以進一步研究循環(huán)miRNA在BTCs患者中的意義仍是以后科研及臨床的迫切需求。