激勵(lì)電壓對銅脅迫下水稻葉片電阻抗參數(shù)影響研究

王婧 殷華

摘 要：以不同濃度的銅離子脅迫作為基礎(chǔ)，采用0.5v，1v，2v等3種激勵(lì)電壓研究對水稻葉片電阻抗測量結(jié)果的影響。結(jié)果表明，電阻抗測量結(jié)果與測量時(shí)激勵(lì)電壓的選擇有密切關(guān)系：在低濃度短時(shí)間的銅脅迫后，0.5v激勵(lì)電壓所得阻抗結(jié)果與1v、2v激勵(lì)電壓所得結(jié)果差別較大;而在高濃度長時(shí)間脅迫后，三者差異并不明顯。

關(guān)鍵詞：水稻;電阻抗;激勵(lì)電壓;銅脅迫

中圖分類號 S511.4+2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）21-0023-04

Abstract：Rice is one of the most important food crops in China，and it is easy polluted by heavy metal because of the process of industrialization is speeded up. As a simple detection method，impedance parameters are widely used in the detection and estimation of plant heavy metal pollution. However，most of the researchers are limited to fit and calculate of the parameters，and ignored the influence of the excitation voltage on the measurement. This paper discussed on the influence of three excitation voltages （0.5v，1v and 2v） at copper ion stress environment. Results shows that selection of excitation voltage is related to the measurement results：after short period of copper stress at low concentrations，the impedance at 0.5v is quite different with 1v or 2v，nevertheless，there is no difference after long period stress with high concentration.

Key words：Rice;Impedance;Excitation voltage;CU stress

水稻是我國重要的糧食作物之一。據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2018年全國稻谷播種面積約為3018.9萬hm2，平均單產(chǎn)7.027t/hm2，總產(chǎn)21213萬t。但是，近年來隨著我國工業(yè)化程度的不斷推進(jìn)，水稻的種植環(huán)境正逐漸受到各種重金屬元素的污染。銅作為一種與人類關(guān)系密切的有色金屬，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于機(jī)械制造、建筑工業(yè)、國防工業(yè)等領(lǐng)域。但過多的銅通過污水排放滲入到地下后，一定程度上增加了對水稻的污染機(jī)率。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道，少量的銅能促進(jìn)水稻相關(guān)蛋白的分泌，有利于植物的生長發(fā)育[1];但相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，重金屬對水稻的脅迫程度與其劑量有顯著的相關(guān)性，若將水稻長期暴露在銅離子下，其產(chǎn)生的累積效應(yīng)不但會帶來毒性阻礙生長、對其DNA造成損傷，而且會通過直接或食物鏈的傳遞對人類的肝臟、腎臟健康造成損害[2]。因此，如何對水稻中累積的銅進(jìn)行早期檢測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和制止污染行為，對保證水稻安全，保障人們身體健康具有重要意義[4-6]。

傳統(tǒng)的重金屬元素含量檢測通常以化學(xué)方法為主：在對檢測區(qū)域的土壤或植物進(jìn)行取樣后，采用試劑分離的方法定量獲取重金屬的含量，這種方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但是過程較為繁瑣，對實(shí)驗(yàn)者的操作水平及相關(guān)儀器設(shè)備依賴性較高;而另外一種更為常見的手段是通過觀察植物在重金屬環(huán)境下的生理、生化反應(yīng)并構(gòu)建模型，以此來得到其受到重金屬污染的程度，包括近紅外、LIBS光譜等。電阻抗圖譜法是19世紀(jì)后期來發(fā)展起來的一種快速、非破壞性測定方法，其通過獲取不同頻率、電壓下植物組織的電阻和電抗變化，結(jié)合等效電路模型來得到植物胞外電阻、胞內(nèi)電阻等參數(shù)，并以此直接或間接反應(yīng)生物細(xì)胞受到環(huán)境因素脅迫時(shí)的物理、化學(xué)變化。通過近30年的發(fā)展，電阻抗圖譜法應(yīng)用范圍正逐漸擴(kuò)展，從估計(jì)作物活力、營養(yǎng)狀況到耐干旱、耐寒程度等都具有良好的表現(xiàn)，這為研究植物受環(huán)境因素脅迫的程度提供了依據(jù)[7-8]。但目前應(yīng)用電阻抗圖譜法來反應(yīng)重金屬對作物葉片的脅迫多集中于模型的確立與數(shù)據(jù)的擬合，其基本思路是分別測得作物的電阻和電抗，以電阻為實(shí)部、電抗為虛部作圖得到電阻抗圖譜的弧數(shù)和偏度，并以此確定究竟是使用集總模型還是分布模型，而后根據(jù)模型的等效電路表達(dá)，利用復(fù)最小二乘法進(jìn)行擬合得到諸如弛豫時(shí)間、弛豫時(shí)間分布系數(shù)、細(xì)胞外電阻、細(xì)胞內(nèi)電阻等參數(shù)。從中不難看出，為了得到準(zhǔn)確的結(jié)果，電阻和電抗值的獲取非常關(guān)鍵，但目前現(xiàn)有的研究大多只關(guān)心測量時(shí)的激勵(lì)頻率，對激勵(lì)電壓的選擇討論較少，而通常植物生理模型較為復(fù)雜，對激勵(lì)電壓的反應(yīng)也各不相同，因此，當(dāng)激勵(lì)電壓發(fā)生變化時(shí)，電阻抗的結(jié)果應(yīng)該也有所不同。本試驗(yàn)通過分析在銅脅迫下水稻葉片電阻抗參數(shù)變化，探索激勵(lì)電壓的選擇對電阻、電抗測量結(jié)果的影響，為準(zhǔn)確選擇激勵(lì)電壓、利用電阻抗參數(shù)來診斷水稻重金屬污染程度提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)選取江西省水稻生產(chǎn)常用的品種金優(yōu)458，在不同脅迫下進(jìn)行葉片阻抗測量。試驗(yàn)場地為學(xué)校農(nóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)站，水稻種植采用桶培方式進(jìn)行，培育桶為圓形紅色塑料桶，高40cm。為了保持一致性，水稻培育周期中所用的全部土壤從同一地區(qū)獲取，每桶裝風(fēng)干土10kg。土壤質(zhì)地為中壤土，有機(jī)質(zhì)19.46g/kg，堿解氮112.31mg/kg，速效磷11.65g/kg，速效鉀123.84g/kg，全氮1.02g/kg，全磷0.48g/kg，全鉀12.22g/kg，肥力中等。按25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg含量，分別向不同的桶中添加CuSO4·5H2O溶液進(jìn)行銅脅迫處理，秧齡1個(gè)月左右，選擇晴天進(jìn)行移栽，每桶2穴，每穴3株，每種濃度的CuSO4·5H2O溶液各處理5桶。向每桶中施基肥N1.2g、P2O51.2g，K201.4g，栽培按常規(guī)管理方法進(jìn)行，保證各個(gè)生長期處于合理的溫、濕環(huán)境

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每次每組均剪取不少于6個(gè)樣品，再隨機(jī)選取3個(gè)樣品進(jìn)行測試。進(jìn)入分蘗期后，每隔5d取不同組別的水稻葉片進(jìn)行分析，測量電阻、電抗參數(shù)。

1.2.2 測量方法 樣品電阻、電抗測量方法參考T.Repo的方法進(jìn)行，避開水稻葉片的主莖剪取4mm×10mm大小的樣本，分別在開路和短路條件下校正阻抗分析（TH2832），結(jié)束后開始測量樣本在48個(gè)頻率下（20Hz～200Hz）的電阻和電抗值。測量時(shí)，保持測量電極通過導(dǎo)電凝膠與水稻葉片良好接觸，每個(gè)樣本測量不少于10次，激勵(lì)電壓分別選取0.5v、1v和2v，以此來驗(yàn)證不同電壓對阻抗的影響程度。水稻種植土壤、葉片等試驗(yàn)樣品中銅的含量采用激光誘導(dǎo)擊穿試驗(yàn)系統(tǒng)（libs）對試驗(yàn)土壤、不同銅濃度脅迫下的水稻葉片進(jìn)行測試。根據(jù)式（1）所示的羅馬金-賽伯公式，測量所得的光譜強(qiáng)度與元素含量有對應(yīng)的關(guān)系，因此，通過觀察激光誘導(dǎo)擊穿光譜的強(qiáng)度，可以很好的得到待測元素的含量[11]：

1.2.3 試驗(yàn)儀器設(shè)備 試驗(yàn)所用LIBS系統(tǒng)采用ND-YAG脈沖激光器作為激發(fā)光源（VLITE-200型，北京鐳寶光電技術(shù)有限公司），中心工作波長為1064nm，脈沖寬度6～8ns。激光反射處理后聚焦在待測樣品表面。產(chǎn)生的激光等離子體光譜信號通過石英透鏡耦合至光纖，最后再傳輸至光譜儀（AVASPEC-ULS2048-2，荷蘭愛萬提斯技術(shù)有限公司，波長210～473nm，分辨率0.08～0.16nm）完成光譜的分光與光電轉(zhuǎn)換。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，在測量前對對水稻葉片則采用自然風(fēng)干處理。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)NIST數(shù)據(jù)庫，對CU元素的鑒別常用324.75nm和327.39nm兩根譜線進(jìn)行，且通常324.75nm譜線約為327.39nm譜線強(qiáng)度的2倍。根據(jù)具體情況選用譜線作為銅元素含量的鑒別。如圖1的土壤libs光譜曲線，由于其中的元素比較豐富，324.75nm譜線較易受Ti元素譜線324.86nm干擾而造成誤判，因此對土壤中存在的CU元素判定通常以327.40nm為依據(jù);葉片中由于元素種類較為單一，采用2根譜線進(jìn)行判別[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻葉片外觀對銅脅迫的響應(yīng) 由圖2可見，在脅迫前，各試驗(yàn)桶中移栽的水稻葉片libs光譜數(shù)據(jù)并無顯著差別。而在經(jīng)過銅脅迫后，從外觀上看，根據(jù)添加CuSO4·5H2O溶液的濃度不同，水稻葉片葉色、葉面積變化明顯，特別是在200mg/kg濃度溶液的脅迫下，葉色出現(xiàn)變淡、葉面積變小等現(xiàn)象。為了明確水稻葉片中銅的富集程度，測量經(jīng)過不同濃度銅脅迫后各水稻葉片的LIBS光譜數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，經(jīng)過脅迫后，水稻葉片中所累積的銅出現(xiàn)明顯差異，而光譜數(shù)據(jù)中其它元素含量沒有出現(xiàn)顯著差別，故在此基礎(chǔ)上對同樣葉片進(jìn)行電阻抗分析，其所得差異是銅元素導(dǎo)致。

2.2 相同濃度銅脅迫不同激勵(lì)電壓的影響 隨著脅迫時(shí)間的推移，越來越多的銅離子將隨著水稻根系的吸收進(jìn)入葉片內(nèi)部，繼而引起其細(xì)胞發(fā)生變化，對阻抗產(chǎn)生一定的影響，圖3是在25mg/kg濃度的銅溶液脅迫下，采用相同的激勵(lì)電壓5d、10d和15d后的阻抗變化曲線。由圖3可見，在0.5v、1v、2v激勵(lì)下阻抗都會隨著時(shí)間的推移逐漸出現(xiàn)變化。以5d阻抗曲線為對照，在0.5v電壓激勵(lì)下，脅迫10d后的阻抗曲線峰值減少了21.3%，脅迫15d后的阻抗曲線峰值減少了了45.1%;在1v電壓激勵(lì)下，脅迫10d后的阻抗曲線峰值減少了51.4%，脅迫15d后的阻抗曲線峰值減少了64.2%;同樣的情況在2v電壓激勵(lì)也出現(xiàn)，脅迫10d后的阻抗曲線峰值減少了54.5%，15d后的阻抗曲線峰值減少了63.2%。

各種濃度的銅溶液脅迫后采用不同電壓激勵(lì)的阻抗峰值響應(yīng)結(jié)果變化見圖4，由圖4可以看出，在25mg/kg濃度的銅溶液脅迫下采用0.5V電壓激勵(lì)與阻抗峰值接近于線性關(guān)系，而若采用高激勵(lì)電壓，則在脅迫初期阻抗的變化會較大，但是隨著時(shí)間的推移，這種變化趨于一致，并且不論是1v還是2v激勵(lì)，阻抗峰值幾乎一致。而在50mg/kg時(shí)3種激勵(lì)電壓的峰值逐漸靠近，呈現(xiàn)出一致性的趨勢，表現(xiàn)為近似線性關(guān)系;但在高濃度的脅迫（大于100mg/kg）時(shí)，采用何種電壓對阻抗峰值幾乎沒有影響，不同脅迫時(shí)間得到的阻抗峰值幾乎相同，這說明此時(shí)選用何種激勵(lì)電壓進(jìn)行阻抗測量對于高濃度的脅迫來說關(guān)系不大。

2.3 相同激勵(lì)電壓不同濃度銅脅迫的影響 有研究表明，銅離子的濃度會對水稻的品質(zhì)造成影響[6]，當(dāng)環(huán)境中出現(xiàn)過多的銅離子后，其會通過水稻根系吸收，最終沉淀在糠層、谷殼和精米中。因此，在相同的脅迫時(shí)間里，激勵(lì)電壓能否對銅離子脅迫的濃度進(jìn)行表達(dá)，采用多少激勵(lì)電壓最有利于辨識出脅迫程度是值得研究的問題。在5d時(shí)間的脅迫后，采用0.5v激勵(lì)電壓時(shí)的阻抗曲線如圖5（a）所示。由圖5（a）可以看出，4種濃度的銅脅迫在0.5v激勵(lì)電壓下其阻抗峰值分別為74.4kΩ、62.7kΩ、41.2kΩ及39.8kΩ，同樣以25mg/kg濃度作為對照，分別減少了15.7%、44.6%、46.5%。而在1v電壓激勵(lì)下，它們的阻抗峰值分別變化為97.95kΩ、48.14kΩ、37.1kΩ及38.2kΩ，相對于25mg/kg濃度時(shí)分別減少了50.8%、62.1%、61%。在2v電壓激勵(lì)下，這種情況再次出現(xiàn)，阻抗峰值分別變?yōu)榱?5.8kΩ、42.5kΩ、36.2kΩ及37.9kΩ，相對于參照的25mg/kg濃度，分別減少了55.6%、62.2%、60.4%。

不同銅濃度脅迫下激勵(lì)電壓對電阻抗峰值的影響結(jié)果見圖6，由圖6可以看出，當(dāng)脅迫初期且濃度較低時(shí)，0.5v激勵(lì)電壓與1v、2v激勵(lì)電壓所產(chǎn)生的阻抗峰值具有明顯差別，但當(dāng)脅迫的濃度逐漸升高后，1v和2v激勵(lì)電壓所造成的阻抗峰值變化率較高;然而，當(dāng)濃度超過100mg/kg后這種差異反而變得并不十分明顯。圖6（b）、（c）分別為脅迫10d、15d后，脅迫濃度與阻抗峰值的關(guān)系，在低濃度脅迫時(shí)，同樣不論采用何種激勵(lì)電壓，其阻抗變化率較高，但當(dāng)濃度超過100mg/kg后這種差異也十分微小，似乎水稻在吸收銅離子時(shí)出現(xiàn)了飽和效應(yīng)，具體原因有待于后續(xù)研究揭示。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同的種植環(huán)境下，經(jīng)過不同設(shè)計(jì)范圍的銅離子脅迫后，水稻電阻抗參數(shù)會出現(xiàn)相應(yīng)的變化，結(jié)果與實(shí)驗(yàn)時(shí)的激勵(lì)電壓、重金屬脅迫濃度、脅迫時(shí)間均有一定的關(guān)系。在低濃度、短時(shí)間的銅脅迫下，采用0.5v激勵(lì)電壓所得到的電阻抗峰值曲線與采用1v、2v激勵(lì)電壓所得到的電阻抗峰值曲線有顯著區(qū)別。而在高濃度的銅脅迫下，這種差異反而變得不太明顯。當(dāng)脅迫時(shí)間較短且脅迫濃度小100mg/kg時(shí)，0.5v激勵(lì)電壓得到的電阻抗峰值變化率較小，而在大于100mg/kg脅迫濃度的場合或脅迫時(shí)間較長后的阻抗測量則采用何種電壓并無差異。因此，在低濃度的短時(shí)間的銅脅迫時(shí)，可以考慮采用低電壓進(jìn)行激勵(lì)，而對于長時(shí)間高濃度的銅脅迫，采用何種電壓激勵(lì)所得阻抗結(jié)果相差不大。但具體是何種原因?qū)е逻@種現(xiàn)象的發(fā)生，其它重金屬元素是否也會導(dǎo)致出現(xiàn)類似的結(jié)論，還需通過試驗(yàn)進(jìn)行深入分析。

參考文獻(xiàn)

[1]國家統(tǒng)計(jì)局.國家統(tǒng)計(jì)局關(guān)于2018年糧食產(chǎn)量的公告[EB/OL]，2018-12-14/2019-3-10

[2]丁文，吳勝春，朱成，等.水稻響應(yīng)重金屬脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].環(huán)境污染與防治，2018，40（1）：95-99.

[3]葛才林，楊小勇，孫錦荷，等.重金屬脅迫引起的水稻和小麥幼苗DNA損傷[J].分子植物（英文版），2002，28（6）：419-424.

[4]劉明.基于監(jiān)測指標(biāo)和同化策略優(yōu)化的水稻重金屬脅迫評估[D].北京：中國地質(zhì)大學(xué)（北京），2017.

[5]楊小勇.重金屬脅迫對水稻傷害機(jī)理及水稻耐性機(jī)制的研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2002.

[6]徐加寬.土壤Cu含量對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響及其原因分析[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2005.

[7]劉曉紅，王國棟，張鋼.外源重金屬脅迫對小麥葉片電阻抗參數(shù)的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（6）：2014-2020.

[8]劉曉紅，黃廷林，王國棟，等.小麥葉片電阻抗圖譜參數(shù)對重金屬脅迫的響應(yīng)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，48（5）：114-119.

[9]殷敬峰，李華興，盧維盛，等.不同品種水稻對Cu積累分配的差異[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19（2）：334-339.

[10]丁園，田力偉，羅應(yīng)錦，等.銅脅迫對水稻種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].南昌航空大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，22（2）：86-89.

[11]Repo T，Oksanen E，Vapaavuori E. Effects of elevated concentrations of ozone and carbon dioxide on the electrical impedance of leaves of silver birch（Betula pendula）clones[J].Tree Physiology，2004，24：833-843.

[12]孫曉暉，炊白白，王順，等.激光誘導(dǎo)擊穿光譜定量分析土壤中Cu的研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，48（6）：770-773.

[13]谷艷紅.土壤重金屬激光誘導(dǎo)擊穿光譜定量分析研究[D].合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2017.

（責(zé)編：張宏民）