耐亞胺培南銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)及其耐藥性分析

張雪松

[摘要] 目的 探討該院耐亞胺培南銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法，并了解該地區(qū)耐亞胺培南銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的耐藥特征，為該院對(duì)銅綠假單胞菌的控制提供依據(jù)。方法 方便選取65例2017年7月—2018年12月在該院住院治療的患者的標(biāo)本，臨床分離了65株銅綠假單胞菌，對(duì)其進(jìn)行菌種的鑒定和藥物的敏感試驗(yàn)。采用E-test試驗(yàn)對(duì)金屬酶進(jìn)行檢測(cè)，采用PCR法擴(kuò)增產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的基因，并進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)擴(kuò)增的陽性產(chǎn)物。結(jié)果 65株銅綠假單胞菌的標(biāo)本中以呼吸道分泌物最多，占比81.54%（53株），在分布上呼吸內(nèi)科、ICU病房比較高，分別占了總數(shù)的33.85%（22株）和36.92%（24株）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，有18株（27.69%）銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥，并且大多為多重耐藥菌株;E-test試驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性金屬酶4株，檢出率為22.22%;PCR法擴(kuò)增金屬酶基因陽性3株（4.62%），其中IMP-1和VIM-2分別為3株和1株。結(jié)論 該地區(qū)耐亞胺培南的18株銅綠假單胞菌中大多為多重耐藥菌株，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶在銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥中發(fā)揮著極其重要的作用，并且IMP-1和VIM-2為酶的主要基因型。

[關(guān)鍵詞] 亞胺培南;銅綠假單胞菌;產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶;耐藥性;基因型;藥敏試驗(yàn);PCR法

[中圖分類號(hào)] R378.99? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-0742（2019）09（c）-0178-03

[Abstract] Objective To investigate the detection method of metallo-β-lactamase produced by imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in the hospital， and to understand the metallo-β-lactamase production by imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in the region. The drug resistance characteristics provide a basis for the control of Pseudomonas aeruginosa in the hospital. Methods A total of 65 specimens of patients hospitalized in the hospital from July 2017 to December 2018 were conveniently selected. 65 strains of Pseudomonas aeruginosa were isolated and identified for their strains and drug sensitivity tests. The metalloenzyme was detected by the E-test test， and the gene for producing metal β-lactamase was amplified by PCR， and further amplified to confirm the positive product. Results Of the 65 strains of Pseudomonas aeruginosa， the respiratory secretions were the most， accounting for 81.54% （53 strains）. The distribution of upper respiratory medicine and ICU wards was relatively high， accounting for 33.85% （22 strains） and 36.92% （24 strains）. The results of drug susceptibility test showed that 18 strains （27.69%） of Pseudomonas aeruginosa were resistant to imipenem， and most of them were multi-drug resistant strains; E-test test results showed that 4 positive metalloenzymes， detection rate was 22.22%; 3 strains （4.62%） were positive for metalloenzyme gene by PCR， among which IMP-1 and VIM-2 were 3 strains and 1 strain， respectively. Conclusion Most of the 18 strains of Pseudomonas aeruginosa resistant to imipenem in the region are multi-drug resistant strains. The production of metal β-lactamase plays an important role in the resistance of Pseudomonas aeruginosa to imipenem. The role of IMP-1 and VIM-2 is the major genotype of the enzyme.

[Key words] Imipenem; Pseudomonas aeruginosa; Metallo-producing β-lactamase; Drug resistance; Genotype; Drug sensitivity test; PCR method

銅綠假單胞菌（PA）是一種導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要條件致病菌，其會(huì)引發(fā)菌血癥、腦膜炎、院內(nèi)肺炎、術(shù)后傷口感染、泌尿系統(tǒng)感染等病癥[1]。而多重耐藥的PA由于其耐藥范圍比較廣，并且能夠?qū)Χ喾N抗生素表現(xiàn)出耐藥性，但是臨床上對(duì)于治療受到PA感染患者的有效藥物卻比較少。近年來，隨著臨床上抗生素的廣泛使用，細(xì)菌對(duì)亞胺培南等藥物的耐藥率也呈現(xiàn)出了逐年上升的趨勢(shì)[2]。有研究人員在研究中發(fā)現(xiàn)，PA對(duì)亞胺培南的耐藥率在逐漸下降，而導(dǎo)致PA對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制比較多，如碳青霉烯酶的產(chǎn)生、ESBLs等，而因?yàn)楫a(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBLs）導(dǎo)致PA對(duì)抗生素耐藥的情況也在逐年增加[3]。由于MBLs具有整合子的傳播性，隨時(shí)都可引起MBLs院內(nèi)感染事件的爆發(fā)和流行[4]。該次方便收集了65例2017年7月—2018年12月在該院住院治療的患者的標(biāo)本，臨床分離了65株銅綠假單胞菌，對(duì)其進(jìn)行菌種的鑒定和藥物的敏感試驗(yàn)，并對(duì)耐亞胺培南的PA進(jìn)行了MBLs檢測(cè)和耐藥性分析，進(jìn)一步了解了該院內(nèi)亞胺培南耐藥PA的特點(diǎn)以及其產(chǎn)生金屬酶的情況?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

方便選取65例在該院住院治療的患者的標(biāo)本，臨床分離了65株銅綠假單胞菌菌株。

1.2? 菌株鑒定以及藥敏試驗(yàn)

對(duì)其進(jìn)行菌種的鑒定和藥物的敏感試驗(yàn)。采用哥倫比亞瓊脂以及相關(guān)的鑒定卡片對(duì)該次收集到的65株分離菌種進(jìn)行鑒定。然后采用MH瓊脂以及相應(yīng)的抗生素紙片對(duì)65株菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。該次試驗(yàn)中判斷亞胺培南和美洛培南敏感性的標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)最低抑菌濃度≤4 μg/mL時(shí)判斷為敏感，當(dāng)最低抑菌濃度=8 μg/mL時(shí)判斷為中介，當(dāng)最低抑菌濃度≥16 μg/mL時(shí)判斷為耐藥[5]。該次試驗(yàn)均按照相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行規(guī)范化操作，最后對(duì)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.3? E-test試驗(yàn)

采用E-test試驗(yàn)對(duì)金屬酶進(jìn)行檢測(cè)，取鑷子將拭條夾起放在涂布為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏膩啺放嗄夏退幘鷳乙旱沫傊砻嫔?，放在溫度?6 ℃的環(huán)境下孵育18～24 h，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行觀察。以E-test試驗(yàn)說明書中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)對(duì)其結(jié)果進(jìn)行判定：當(dāng)MIC比值>8時(shí)，也就是當(dāng)EDTA/亞胺培南的MIC下降值≥8倍時(shí)，判斷為菌株產(chǎn)金屬酶[6]。

1.4? PCR擴(kuò)增試驗(yàn)對(duì)MBLs基因型別進(jìn)行檢測(cè)

采用核酸提取盒對(duì)65株P(guān)A的DNA進(jìn)行提取，設(shè)計(jì)出檢測(cè)MBLs編碼基因的PCR產(chǎn)物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。將其送往該市基因科技公司對(duì)PA的IMP基因和VIM基因進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

2? 結(jié)果

2.1? PA在該次分離標(biāo)本中的構(gòu)成比

65株銅綠假單胞菌的標(biāo)本中以呼吸道分泌物最多，占比81.54%（53株），其次為膿液7株，占比10.77%，傷口分泌物3株，占比4.62%，其他2株，占比3.08%。

2.2? PA在該院科室中的分布

在分布上呼吸內(nèi)科、ICU病房比較高，在分布上呼吸內(nèi)科、ICU病房比較高，分別占了總數(shù)的33.85%（22株）和36.92%（24株），其次為急診、胸外科和骨科。

2.3? PA臨床分離菌株對(duì)12種藥物的耐藥率

65株P(guān)A對(duì)阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南、亞胺培南、美洛培南的耐藥率分別為：41.54%、49.23%、50.77%、32.31%、23.07%、36.92%、64.62%、49.23%、24.62%、29.23%，對(duì)多粘菌素的敏感率為50.77%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，有18株（27.69%）銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥，并且有16株（88.89%）為多重耐藥菌株。這些菌株對(duì)氨基糖苷類、頭孢類、氟喹諾酮類、碳青霉烯類、含有酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺類等抗菌藥物中的3類或者3類以上耐藥。18株多重耐藥菌株中有8株（44.44%）為廣泛耐藥菌株，其對(duì)除哌拉西林以外的其余11類常用藥物的耐藥率均為100.00%。18株耐亞胺培南PA的耐藥情況比較嚴(yán)重，對(duì)臨床上12種常用藥物中的11種藥物的耐藥率均超過50.00%。見表1。

2.4? 亞胺培南耐藥組與敏感組金屬酶表型和基因型的檢測(cè)

65株P(guān)A經(jīng)E-test試驗(yàn)，結(jié)果顯示，18株亞胺培南耐藥組中檢出陽性金屬酶4株，檢出率為22.22%，47株亞胺培南敏感菌株中未檢出金屬酶陽性菌株。檢出率為0.00%。PCR法擴(kuò)增金屬酶基因陽性3株（4.62%），其中IMP-1和VIM-2分別為3株和1株，其他幾種基因型的β-內(nèi)酰胺酶（如SPM、GIM、SIM、AIM、KHM、DIM、NDM）均未檢出。

3? 討論

該次研究中收集了65例2017年7月—2018年12月在該院住院治療的患者的標(biāo)本，臨床分離了65株銅綠假單胞菌，其中以呼吸道分泌物最多，占比81.54%（53株），分布在上呼吸內(nèi)科、ICU病房的菌株分別為22株（33.85%）和24株（36.92%）。萬強(qiáng)等人[7]在研究中，選取了臨床分離的400株銅綠假單胞菌，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示，400株銅綠假單胞菌中，呼吸道分泌物最多，占比81.50%（326株），分布在上呼吸內(nèi)科、ICU病房的菌株分別為79株（19.8%）和102株（25.5%）。該次研究結(jié)果與萬強(qiáng)等人[7]的研究結(jié)果是一致的，進(jìn)一步提示院內(nèi)呼吸內(nèi)科和ICU是PA感染的高發(fā)區(qū)域[8]。對(duì)其進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，這可能是由于ICU患者免疫力比較低，呼吸內(nèi)科患者的痰液不容易被排出，增加了患者誤吸的幾率，同時(shí)，呼吸內(nèi)科患者呼吸機(jī)等器械的頻繁使用均增加了呼吸道感染的幾率[9]。

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物臨床應(yīng)用比較廣泛，其包括β-內(nèi)酰胺類、青霉素類、頭孢類、碳青霉烯類等[10]。該次分離的65株P(guān)A對(duì)哌拉西林、亞胺培南、美洛培南的耐藥率分別為23.07%、24.26%和29.23%，因此發(fā)現(xiàn)，在該院β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物依然是臨床治療PA重癥感染患者的首選藥物。但是由于臨床上對(duì)抗生素的不合理使用，導(dǎo)致PA對(duì)亞胺培南的耐藥率逐漸升高，并且對(duì)耐亞胺培南PA菌株的檢出率也在逐漸升高，這也給臨床治療帶來了較大的困難[11]。該次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，有18株銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥，并且大多為多重耐藥菌株。提示PA能夠?qū)箯V泛的耐藥種類，并且其耐藥水平還比較高。E-test試驗(yàn)結(jié)果顯示，18株亞胺培南耐藥組中檢出陽性金屬酶4株，檢出率為22.22%，47株亞胺培南敏感菌株中未檢出金屬酶陽性菌株。檢出率為0.00%。該次研究中針對(duì)上述基因設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金屬酶基因陽性3株（4.62%），其中IMP-1和VIM-2分別為3株和1株。而其他幾種基因型的β-內(nèi)酰胺酶（如SPM、GIM、SIM、AIM、KHM、DIM、NDM）均未檢出，這與Samaneh Shirazi等人[12]的研究結(jié)果是一致的。

綜上所述，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶所引起的細(xì)菌感染事件的增加和流行敲響了警鐘，臨床上應(yīng)加強(qiáng)對(duì)抗菌藥物的規(guī)范使用。該院耐亞胺培南的18株銅綠假單胞菌中大多為多重耐藥菌株，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶在銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥中發(fā)揮著極其重要的作用，并且IMP-1和VIM-2為酶的主要基因型。臨床上應(yīng)加強(qiáng)對(duì)PA耐藥性的監(jiān)測(cè)，并加強(qiáng)預(yù)防為主，避免長(zhǎng)期使用同一種類型的抗菌藥物，同時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)病原學(xué)的檢查，根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果選擇正確的抗菌藥物，以達(dá)到最佳的治療效果，并做好院內(nèi)感染的預(yù)防和控制。

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（收稿日期：2019-06-28）