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    增齡對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后TLR-4的影響

    2019-12-09 01:51:15林運(yùn)靈
    中外醫(yī)療 2019年27期
    關(guān)鍵詞:炎癥

    林運(yùn)靈

    [摘要] 目的 探討增齡對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后TLR-4及相關(guān)炎癥因子的影響。方法 選取該院于2018年1—6月間實(shí)驗(yàn)室以青年(3月齡)及老年(18月齡)清潔級(jí)健康雄性SD大鼠建立心肌缺血再灌注模型,依據(jù)鼠齡分為:①假手術(shù)青年組(Sham-Y組)及假手術(shù)老年組(Sham-A);②心肌缺血再灌注青年組(IR-Y組)及心肌缺血再灌注老年組(IR-A組)。檢測(cè)大鼠心肌梗死面積、炎癥因子變化,蛋白電泳分析TLR-4表達(dá)的變化。結(jié)果 與Sham-Y組相比, Sham-A組TNF-α(30.1±5.3)ng/mL、IL-6水平(34.2±3.7)pg/mL顯著增高(P<0.05);缺血再灌注后,與IR-Y組相比,IR-A組心肌梗死面積顯著增大;與IR-Y組相比,IR-A組血清TNF-α(421.2±56.9)ng/mL、IL-6水平(129.3±11.5)pg/mL顯著增高(P<0.05),血清IL-10水平(48.2±4.1)pg/mL顯著減低(P<0.05);與IR-Y組相比,IR-A組TLR-4表達(dá)顯著增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 增齡導(dǎo)致心肌缺血再灌注后心肌TLR-4及其相關(guān)炎癥因子表達(dá)增強(qiáng)。

    [關(guān)鍵詞] 心肌缺血再灌注損傷;Toll樣受體;炎癥

    [中圖分類號(hào)] R54? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-0742(2019)09(c)-0008-03

    [Abstract] Objective To observe the effects of aging on TLR-4 and related inflammatory factors after myocardial ischemia-reperfusion in rats. Methods The model was established in the laboratory from January to June 2018. The model of myocardial ischemia-reperfusion was established in young (3 months old) and old (18 months old) clean-grade healthy male SD rats, 1.sham-operated group (Sham-Y group) and sham-operated group (Sham-A); 2.myocardial ischemia-reperfusion group (IR-Y group) and myocardial ischemia-reperfusion group (IR-A group). The myocardial infarct size and inflammatory factors were detected in rats, and the expression of TLR-4 was analyzed by protein electrophoresis. Results Compared with Sham-Y group, TNF-α (30.1±5.3)ng/mL and IL-6 level(34.2±3.7)pg/mL were significantly increased in Sham-A group (P<0.05). After ischemia-reperfusion, compared with the IR-Y group, the area of myocardial infarction in the IR-A group was significantly increased; compared with the IR-Y group, the serum TNF-α(421.2±56.9) ng/mL and IL-6 levels in the IR-A group (129.3±11.5)pg/mL was significantly increased (P<0.05), serum IL-10 level (48.2±4.1) pg/mL was significantly decreased (P<0.05); IR-A group TLR-4 expression was significantly enhanced compared with IR-Y group, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion Age-induced myocardial TLR-4 and its related inflammatory factors are enhanced after myocardial ischemia and reperfusion.

    [Key words] Myocardial ischemia-reperfusion injury; Toll-like receptor; Inflammation

    心血管病仍然是人口首位死亡原因[1],受老齡化的影響,心血管病患病及死亡的絕對(duì)人數(shù)仍在持續(xù)上升[2],給社會(huì)及家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。與青年人相比,老年人心血管病預(yù)后更差。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與青年小鼠相比,老齡小鼠在心肌梗死后梗死區(qū)域擴(kuò)展更為嚴(yán)重,心功能更差[3];諸多有效的干預(yù)措施如缺血后處理等在老年動(dòng)物心臟也喪失其保護(hù)作用[4]。老年心臟對(duì)損傷的易感性的機(jī)制仍未得到闡明。

    心梗后炎癥反應(yīng)為心臟修復(fù)所必需,TLR(Toll-like receptor,TLR)介導(dǎo)的內(nèi)源性免疫反應(yīng)是心肌缺血再灌注后炎癥反應(yīng)的重要組成部分。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制Toll樣受體-4(TLR-4)的表達(dá)能夠顯著減輕梗死心肌炎癥反應(yīng),減輕心肌損傷[5]。目前尚不清楚,衰老對(duì)心肌缺血再灌注后TLR-4及其相關(guān)炎癥通路信號(hào)分子表達(dá)是否有影響。

    該研究選取2018年1—6月間該院實(shí)驗(yàn)室參與實(shí)驗(yàn)的小鼠為研究對(duì)象,旨在通過對(duì)3月齡及18月齡大鼠建立心肌缺血再灌注模型,觀察衰老對(duì)心臟TLR-4及其下游炎癥信號(hào)分子的變化,探討TLR-4在衰老大鼠心肌缺血后的作用及其可能機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1? 材料

    1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    2月齡清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠(180~200 g),自由飲食,動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。待各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別飼養(yǎng)至3月齡、18月齡,分別進(jìn)入假手術(shù)及心肌缺血再灌注組。該研究分組:①假手術(shù)組(Sham組):只穿線不結(jié)扎,根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物月齡再分為青年組(Sham-Y組)及老年組(Sham-A組);②心肌缺血再灌注組(IR組):根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物月齡再分為青年組(IR-Y組)及老年組(IR-A組),每組動(dòng)物8只。研究步驟詳見動(dòng)物模型建立部分。

    1.2? 試劑、儀器

    氯化三苯基四氮唑(TTC):美國(guó)Amresco 公司;伊文氏藍(lán):Sigma公司;美國(guó)RD公司TNF-α、IL-6、IL-10? ELISA試劑盒分別購(gòu)于USCN及R&D公司; TLR-4 多克隆抗體及MyD88多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。其余試劑為市售分析純產(chǎn)品。BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng):成都泰盟科技有限公司;小動(dòng)物呼吸機(jī)(TKR-200C):江蘇特力麻醉呼吸設(shè)備公司; Mini Trans-Bloe電泳儀(Bio.Rad公司,美國(guó)),全自動(dòng)凝膠圖象分析儀(Syngene公司,美國(guó)), Image.Pro Plus圖像分析軟件(Media Cybernetics公司,美國(guó))。

    2? 動(dòng)物模型建立及指標(biāo)檢測(cè)

    2.1? 大鼠心肌缺血再灌注模型制備

    缺血再灌注組以穿線結(jié)扎法結(jié)扎左冠脈建立大鼠缺血-再灌注模型[6]。缺血30 min后,松開絲線恢復(fù)血流,缺血心肌顏色從暗紅變?yōu)轷r紅,心電圖顯示抬高的ST段下降1/2,說明再灌注成功,逐層關(guān)胸。在大鼠出現(xiàn)吞咽動(dòng)作后,拔除氣管導(dǎo)管,放入籠中,繼續(xù)保溫,蘇醒后自由飲水進(jìn)食。假手術(shù)對(duì)照組動(dòng)物模型復(fù)制方法同上,但只穿線但不收緊線。

    2.2? 檢測(cè)指標(biāo)與檢測(cè)方法

    2.2.1? 心梗面積測(cè)定? 心肌缺血區(qū)和心肌梗死范圍的測(cè)定按照既往方案進(jìn)行,計(jì)算梗死區(qū)( infarct size, IS)心肌與危險(xiǎn)區(qū)(area at risk,AAR)心肌重量的比值IS/AAR,用以表示心肌梗死范圍的大小。心肌缺血區(qū)范圍用心肌缺血區(qū)重量占左心室重量百分比(AAR/LV)表示。心肌梗死范圍用心肌梗死區(qū)重量占心肌缺血區(qū)重量百分比(IS/AAR)表示。

    2.2.2? 血清TNF-α、IL-6、IL-10含量檢測(cè)? 處死前取靜脈血1 mL,放入含乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的EP管中,混勻后1 400×g離心15 min,取血漿-20℃保存。待標(biāo)本收集齊后,于4℃冰箱自然解凍,按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-10的濃度。

    2.2.3? Westernblot檢測(cè)心肌TLR-4、MyD88表達(dá)? 于再灌注7 d處死動(dòng)物,取保存的心肌組織加入適當(dāng)液氮研磨后,加入細(xì)胞裂解液,充分作用后于100℃加熱,12 000 g/min離心10 min,取上清液,測(cè)定蛋白濃度(根據(jù)樣品濃度調(diào)整上樣蛋白量為50 μg/孔),經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上,脫脂奶粉封閉,加入1: 1000稀釋的一抗,4℃過夜,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測(cè)目標(biāo)蛋白。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,X線膠片壓片,顯影、定影,圖像分析系統(tǒng)測(cè)定目的條帶灰度值,以目的蛋白與GAPDH條帶的吸光面積積分比值來(lái)評(píng)定其蛋白表達(dá)水平。

    3? 統(tǒng)計(jì)方法

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示,用χ2檢驗(yàn)。對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)(Levene檢驗(yàn))及正態(tài)性檢驗(yàn)(F檢驗(yàn))。符合正態(tài)分布組間比較采用One-Way ANOVA分析,組間兩兩比較,方差齊者采用SNK-q檢驗(yàn),方差不齊采用Game-Howell檢驗(yàn);但若數(shù)據(jù)屬于非正態(tài)分布,則采用Kruskal-wallis H檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    4? 結(jié)果

    4.1? 各組心肌缺血與心肌梗死面積比較

    青年組及老年組心肌缺血面積之間[(45.0±3.2)% vs (47.8±4.2)%]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.16,P>0.05)。在心肌缺血再灌注后,與青年組(IR-Y組)相比,老年組(IR-A組)心肌梗死面積顯著增大(42.8±3.4)% vs (55.4±5.1)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.368, P<0.05)。

    4.2? 各組血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比較

    與假手術(shù)組相比,心肌缺血再灌注后,心肌再灌注組血清炎癥因子含量明顯增高。與Sham-Y組相比,Sham-A組血清TNF-α及IL-6水平顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如表1所示,與IR-Y組相比,IR-A組血清TNF-α及IL-6水平顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);IR-A組IL-10水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    4.3? 各組心肌TLR-4、MyD88含量比較

    如圖1所示,與假手術(shù)組相比,心肌缺血再灌注組大鼠心肌TLR-4、MyD88表達(dá)顯著增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Sham-Y組相比,Sham-A組心肌TLR-4、MyD88水平顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)與IR-Y組相比,IR-A組TLR-4、MyD88表達(dá)顯著增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

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