白皮杉醇對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠的治療效果及作用機(jī)制

郭 丹，杜 寧

0引言

視網(wǎng)膜病變是糖尿病眼病中最為嚴(yán)重的可致盲的一種并發(fā)癥，隨著糖代謝發(fā)生紊亂，會(huì)引起視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)損傷，最終發(fā)生血管周細(xì)胞凋亡、血管舒縮調(diào)節(jié)功能異常等視網(wǎng)膜病理改變[1-2]。臨床上對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療雖然能有效對(duì)患者視網(wǎng)膜進(jìn)行保護(hù)，但效果往往不太理想。白皮杉醇屬于白藜蘆醇的衍生物，具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化的作用[3]。有研究表明，血管生成素-2(Ang-2)/Tie-2受體信號(hào)系統(tǒng)在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的作用，且參與視網(wǎng)膜病變血管增殖[4]。在本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用白皮杉醇對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠進(jìn)行干預(yù)，探究其對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療效果及作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料研究動(dòng)物：選擇50只SD健康雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠年齡為6～10(平均7.8±0.5)周齡，體質(zhì)量為220～240(平均228.4±21.5)g，飼養(yǎng)溫度為22℃～25℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時(shí)進(jìn)行紫外線照射消毒。統(tǒng)一喂給標(biāo)準(zhǔn)飼料，允許自由活動(dòng)，飼養(yǎng)時(shí)間為1wk。本研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

主要藥物和試劑：白皮杉醇(購自于成都曼思特生物科技有限公司)，B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)單克隆抗體(上海振譽(yù)生物科技有限公司，bsm-33411M)，Bax單克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司，bsm-33279M)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單克隆抗體(上海群己生物科技有限公司，H00007422-M05)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)單克隆抗體(上海恒斐生物科技有限公司，K000487P)，血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)單克隆抗體(上海莼試生物技術(shù)有限公司，CS-ELISA1280)，血管生成素-1(Ang-1)單克隆抗體(上海群己生物科技有限公司，H00000283-M05)，血管生成素-2(Ang-2)單克隆抗體(武漢博歐特生物科技有限公司，orb77073)，Tie-2單克隆抗體(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，hz126Ra21)；HE染色劑、PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組隨機(jī)選取50只健康SD大鼠中10只作為對(duì)照組，其余40只大鼠建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型。建模過程中對(duì)照組大鼠使用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其余40只大鼠使用高脂高糖的飼料喂養(yǎng)。8wk后，所有大鼠均禁食12h，高脂高糖飼料喂養(yǎng)的40只大鼠腹腔注射40mg/kg的鏈脲佐菌素，對(duì)照組大鼠注射等體積的生理鹽水。3d后采取斷尾措施，采集大鼠尾部靜脈血進(jìn)行血糖檢測(cè)，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖為3+,說明糖尿病模型大鼠建造成功，最終建模成功38只。所有大鼠給予基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，自由活動(dòng)4wk后，觀察大鼠眼底出現(xiàn)明顯的視網(wǎng)膜出血或者滲出、毛細(xì)血管擴(kuò)張及動(dòng)靜脈異常等情況，說明糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠建模成功，最終糖尿病視網(wǎng)膜病變模型建模成功35只。將建模成功的糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠隨機(jī)分為模型組8只、常規(guī)用藥組9只、低劑量白皮杉醇組9只、高劑量白皮杉醇組9只。

1.2.2藥物干預(yù)在糖尿病視網(wǎng)膜病變模型建模成功后，對(duì)五組大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)。常規(guī)用藥組大鼠使用依帕司他進(jìn)行灌胃，劑量為100mg/kg；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠參照杜倩等[5]研究實(shí)驗(yàn)中使用白皮杉醇治療青光眼大鼠的劑量分別使用劑量為100、200mg/kg的白皮杉醇行灌胃治療。對(duì)照組、模型組大鼠給予劑量為100mg/kg的生理鹽水灌胃。五組大鼠均1次/d，連續(xù)給藥4wk。

1.2.3樣本采集在對(duì)大鼠干預(yù)4wk后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死，取大鼠視網(wǎng)膜組織，左眼視網(wǎng)膜組織使用4%多聚甲醛固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作3μm的組織切片，行后續(xù)病理學(xué)觀察。右眼視網(wǎng)膜組織，在液氮冰凍保存。

1.2.4病理學(xué)觀察對(duì)五組大鼠切片樣本進(jìn)行染色處理，使用二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理2次，每次5min，然后在梯度乙醇下水化處理3min，自來水沖洗1次；使用蘇木素染色5min，自來水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸-乙醇分化處理30s，在0.2%氨水中返藍(lán)處理2min，自來水沖洗1次；在濃度0.5%伊紅染色10min，自來水沖洗1次；使用梯度乙醇進(jìn)行脫水處理，最后用中性樹膠進(jìn)行封片，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 Western blot檢測(cè)五組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)取液氮中保存的視網(wǎng)膜組織，研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)蛋白提取，BCA測(cè)定蛋白濃度。取20μg/孔蛋白質(zhì)，通過10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋一抗(1∶1000)，在4℃的環(huán)境下孵育24h；之后TBST緩沖液清洗處理，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1h，使用TBST緩沖液反復(fù)清洗，Tubulin為內(nèi)參照。加入顯影劑將其浸在底物溶液中進(jìn)行顯色，嚴(yán)格按照顯影定影試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)五組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，將采集到的標(biāo)本，取包被液(pH9.5 0.05mol/L CB)適當(dāng)稀釋的抗VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2 0.1mL，添加至聚苯乙烯反應(yīng)板孔中，加蓋后溫度4℃24h，次日使用洗滌劑洗滌3次后，甩干。在各孔中加入稀釋液(pH7.4, 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測(cè)標(biāo)本0.1mL，同時(shí)加入陽性和陰性的對(duì)照標(biāo)本，在43℃置60min，將液體移除洗滌3次后，甩干。在各孔中加入VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2的酶標(biāo)抗體0.1mL，43℃置60min。液體移去后洗滌3次，甩干。在各個(gè)孔中加入底物液(0.1mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8g/L)5.14mL,0.05mol/L枸櫞酸(10.5g/L)4.86mL混勻,加入鄰苯二胺(OPD)4mg，置棕色小瓶中,臨用時(shí)加30% H2O2,混勻，置黑20min，在各孔中加入2mol/L H2SO40.05mL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。分析VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2水平。

圖1五組大鼠視網(wǎng)膜病理組織學(xué)觀察圖HE染色(×400)A:對(duì)照組; B:模型組;C:常規(guī)用藥組;D:低劑量白皮杉醇組;E:高劑量白皮杉醇組。

組別BaxBcl-2對(duì)照組2.40±0.560.18±0.02模型組0.35±0.05a1.26±0.36a常規(guī)用藥組0.76±0.04a,c1.12±0.07a,c低劑量白皮杉醇組1.01±0.21a,c,e0.96±0.21a,c,e高劑量白皮杉醇組1.76±0.05a,c,e,g0.37±0.06a,c,e,g F5.11014.208P<0.001<0.001

注：aP<0.05vs對(duì)照組；cP<0.05vs模型組；eP<0.05vs常規(guī)用藥組；gP<0.05vs低劑量白皮杉醇組。

組別VEGF(ng/mL)HIF-1α(pg/mL)ANGⅡ(ng/mL)對(duì)照組107.28±10.250.30±0.026.57±1.12模型組170.53±15.24a0.65±0.26a9.10±1.98a常規(guī)用藥組146.25±12.15a,c0.50±0.05a,c8.78±1.56a,c低劑量白皮杉醇組140.25±8.10a,c,e0.42±0.02a,c,e8.12±0.09a,c,e高劑量白皮杉醇組121.89±5.45a,c,e,g0.38±0.01a,c,e,g7.58±0.10a,c,e,gF5.71716.2344.032P<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs對(duì)照組；cP<0.05vs模型組；eP<0.05vs常規(guī)用藥組；gP<0.05vs低劑量白皮杉醇組。

2結(jié)果

2.1五組大鼠視網(wǎng)膜病理組織學(xué)觀察如圖1所示，對(duì)五組大鼠視網(wǎng)膜病理組織圖進(jìn)行觀察?？梢妼?duì)照組大鼠視網(wǎng)膜表面光滑，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列緊密、整齊；模型組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界出現(xiàn)明顯水腫，內(nèi)外核層細(xì)胞排列不整齊，可見較多的血管內(nèi)皮細(xì)胞突觸內(nèi)界膜；常規(guī)用藥組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界水腫有所減輕，但仍出現(xiàn)內(nèi)外核層細(xì)胞排列不整齊，仍有較多的血管內(nèi)皮細(xì)胞突觸內(nèi)界膜；低劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜水腫明顯減輕，且血管內(nèi)皮細(xì)胞突觸內(nèi)界膜情況得到改善；高劑量白皮杉醇組大鼠僅出現(xiàn)內(nèi)核層細(xì)胞較排列疏松，血管未見明顯異常。

2.2五組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較如表1所示，模型組、常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax表達(dá)量均低于對(duì)照組，Bcl-2蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax表達(dá)量均高于模型組，Bcl-2蛋白表達(dá)量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax表達(dá)量均高于常規(guī)用藥組，Bcl-2蛋白表達(dá)量均低于常規(guī)用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax表達(dá)量高于低劑量白皮杉醇組，Bcl-2蛋白表達(dá)量低于低劑量白皮杉醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3五組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達(dá)水平比較如表2所示，模型組、常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達(dá)水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達(dá)水平均低于常規(guī)用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達(dá)水平均低于低劑量白皮杉醇組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4五組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達(dá)水平及Ang-1/Ang-2比值比較如表3所示，模型組、常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達(dá)水平均高于對(duì)照組，Ang-1/Ang-2比值低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達(dá)水平均低于模型組，Ang-1/Ang-2比值高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達(dá)水平均低于常規(guī)用藥組，Ang-1/Ang-2比值高于常規(guī)用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達(dá)水平均低于低劑量白皮杉醇組，Ang-1/Ang-2比值高于低劑量白皮杉醇組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

組別Ang-1(μg/L)Ang-2(μg/L)Tie-2(μg/L)Ang-1/Ang-2對(duì)照組7.56±0.982.16±0.122.78±0.233.98±0.56模型組11.59±1.59a6.12±1.00a4.29±0.78a1.70±0.10a常規(guī)用藥組10.12±0.98a,c5.26±0.67a,c3.99±0.67a,c2.10±0.31a,c低劑量白皮杉醇組9.10±0.46a,c,e4.12±0.23a,c,e3.46±0.15a,c,e2.98±0.02a,c,e高劑量白皮杉醇組8.56±0.04a,c,e,g3.24±0.25a,c,e,g3.00±0.04a,c,e,g3.16±0.09a,c,e,g F9.93218.7608.77816.958P<0.001<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs對(duì)照組；cP<0.05vs模型組；eP<0.05vs常規(guī)用藥組；gP<0.05vs低劑量白皮杉醇組。

3討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙跊]有明顯的癥狀，對(duì)視力的影響不明顯，但隨著病情的加重，其視網(wǎng)膜病變會(huì)累及黃斑，導(dǎo)致眼底出血、黃斑水腫、眼底血管閉塞等情況的發(fā)生，嚴(yán)重影響著糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視力，甚至導(dǎo)致患者失明[6-7]。目前常規(guī)西藥治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的效果并不理想，因此本研究為尋找有效治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物，建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠，使用白皮杉醇對(duì)其干預(yù)，探究其治療效果及作用機(jī)制。

白皮杉醇是主要存在于大黃、甘蔗、葡萄中的一種多酚化合物，有研究表明，白皮杉醇不僅具有抗氧化、清除自由基的作用，還具有抗炎、抗菌、保護(hù)心、腦、血管及提高機(jī)體免疫力的作用[8-9]。在本研究中，對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，白皮杉醇能夠有效保護(hù)其視網(wǎng)膜，改善炎癥反應(yīng)，且呈現(xiàn)劑量依賴，高劑量的白皮杉醇改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的程度高于低劑量白皮杉醇。

糖尿病視網(wǎng)膜病變均伴隨著神經(jīng)損傷，其在高血糖、應(yīng)激反應(yīng)谷氨酰胺代謝障礙有著重要的意義[10]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、Bax、Bcl-2水平存在異常表達(dá)，與劉舒靜等[11]、謝安明等[12]、宋麗君等[13]、董白霞等[14]研究認(rèn)為糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視網(wǎng)膜損傷與VEGF、Bax、Bcl-2水平表達(dá)異常有關(guān)的結(jié)果一致，對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠使用藥物干預(yù)后，VEGF、Bax、Bcl-2水平表達(dá)異常情況顯著改善，但使用白皮杉醇干預(yù)的大鼠VEGF、Bax、Bcl-2水平表達(dá)改善程度高于常規(guī)藥物干預(yù)的大鼠，且劑量越高改善越明顯，此結(jié)果說明高劑量的白皮杉醇通過改善VEGF、Bax、Bcl-2水平表達(dá)的異常表達(dá)而對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行保護(hù)。此結(jié)果與張會(huì)嶺等[15]研究中認(rèn)為藥物干預(yù)后通過改善大鼠Bax、Bcl-2異常表達(dá)起到保護(hù)視網(wǎng)膜的作用研究一致。

另外有研究顯示，HIF-1α、ANGⅡ參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展[16-17]。在本研究中，對(duì)五組大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ANGⅡ表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠其HIF-1α、ANGⅡ表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組大鼠，使用藥物進(jìn)行干預(yù)后，高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ANGⅡ的表達(dá)水平顯著降低，說明高劑量白皮杉醇干預(yù)能夠有效抑制HIF-1α、ANGⅡ的異常表達(dá)，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)。

糖尿病視網(wǎng)膜病變后期患者會(huì)出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離，Ang/Tie受體信號(hào)系統(tǒng)參與其發(fā)展。Ang-2可同時(shí)拮抗Ang-1和促進(jìn)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而對(duì)血管基底膜進(jìn)行限制[18-19]。本研究結(jié)果顯示糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2出現(xiàn)異常的表達(dá)，張冬花[20]在其研究中認(rèn)為糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組。本研究進(jìn)一步觀察對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠藥物干預(yù)后Ang-1、Ang-2、Tie-2表達(dá)水平，結(jié)果顯示，高劑量白皮杉醇能夠有效改善大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2的異常表達(dá)，可能是由于高劑量白皮杉醇通過作用于Ang/Tie受體信號(hào)通路而抑制Ang-1、Ang-2、Tie-2的異常表達(dá)，從而起到抑制氧化應(yīng)激損傷及新生血管的生成。

綜上所述，白皮杉醇能夠有效保護(hù)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的視網(wǎng)膜組織，通過作用于Ang/Tie受體信號(hào)通路，抑制炎性因子VEGF、HIF-1α、ANGⅡ的異常表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激損傷、新生血管的生成，且呈劑量依賴，高劑量效果更加顯著，為臨床上治療糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了理論依據(jù)。