蘋(píng)果病毒病致病機(jī)制研究進(jìn)展

弟豆豆 曹曉敏 李裕旗 胡 慧 姜中武,2 趙玲玲,2*

（1煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái)264005；2 山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺(tái)265500）

我國(guó)是世界最大的蘋(píng)果生產(chǎn)國(guó)，蘋(píng)果栽培面積、總產(chǎn)量以及消費(fèi)量居世界首位。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)存在的單產(chǎn)低、品質(zhì)差等問(wèn)題嚴(yán)重影響了我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，蘋(píng)果病毒病是造成這種現(xiàn)象的主要原因之一。開(kāi)展致病機(jī)制研究是進(jìn)行蘋(píng)果病毒病防控的理論依據(jù)。本文總結(jié)了近年來(lái)關(guān)于蘋(píng)果病毒病致病機(jī)制方面的研究結(jié)果，為其流行發(fā)生規(guī)律研究和防控技術(shù)開(kāi)發(fā)提供參考。

1 蘋(píng)果病毒病的種類、分布及危害

蘋(píng)果病毒病在世界各地發(fā)生分布廣泛，目前已報(bào)道的蘋(píng)果病毒有40 多種，包括新發(fā)現(xiàn)的一些病毒或類病毒， 如蘋(píng)果錘頭狀類病毒（AHVD-likeRNA）、 蘋(píng) 果 壞 死 花 葉 病 毒（APNMV）和蘋(píng)果腫枝病毒（AaLV）。根據(jù)病毒危害特點(diǎn)，可以分為潛隱性病毒和非潛隱性病毒。 潛隱性病毒主要包括蘋(píng)果褪綠葉斑病毒（ACLSV）、蘋(píng)果潛隱球形病毒（ALSV）、蘋(píng)果莖溝病毒（ASGV）和蘋(píng)果莖痘病毒（ASPV）；非潛隱性病毒主要包括蘋(píng)果凹果類病毒（ADFVD）、蘋(píng)果銹果類病毒 （ASSVd）、 蘋(píng)果花葉病毒（APMV）等。潛隱性病毒對(duì)果樹(shù)的危害主要是削弱果樹(shù)正常生長(zhǎng)，減少單株產(chǎn)量和果實(shí)大小，還能夠?qū)е聵?shù)勢(shì)衰退、品質(zhì)變劣、嫁接成活率低，根系腐爛，地上部衰退死亡等。非潛隱病毒，除少數(shù)引起減產(chǎn)外（如花葉?。?，大多病樹(shù)喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

我國(guó)蘋(píng)果栽培主要分布于陜西、山東、河南、山西、河北、甘肅、遼寧、新疆等省或自治區(qū)。郝璐等檢測(cè)了山東省、陜西省、山西省、遼寧省、北京市和黑龍江省的蘋(píng)果樣品，結(jié)果表明蘋(píng)果褪綠葉斑病毒的發(fā)生率高達(dá)66.7%~100.0%，蘋(píng)果莖溝病毒的發(fā)生率為38.1%~94.1%、蘋(píng)果莖痘病毒的發(fā)生率為4.8%~85.7%、蘋(píng)果銹果類病毒的發(fā)生率為4.8%~48.6%；蘋(píng)果凹果類病毒僅在山東省的2 個(gè)果園發(fā)現(xiàn)；6 個(gè)省市樣品病毒復(fù)合侵染率分別為67.1%、92.1%、75.0%、88.2%、94.1%和76.2%。李幗英等對(duì)甘肅天水市蘋(píng)果花葉病、蘋(píng)果花臉病等病毒病進(jìn)行了調(diào)查，蘋(píng)果褪綠葉斑病毒檢出率高達(dá)61.1%，蘋(píng)果莖溝病毒檢出率為58.3%；17 個(gè)樣品為單純侵染，13 個(gè)樣品為復(fù)合侵染，樣品整體帶毒率達(dá)到83.3%。

2 蘋(píng)果病毒病的檢測(cè)技術(shù)

病毒檢測(cè)是果樹(shù)病毒病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，蘋(píng)果病毒的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)完善，普遍采用的鑒定方法包括生物學(xué)鑒定法、血清學(xué)鑒定法、分子生物學(xué)鑒定法。

2.1 生物學(xué)鑒定法(又稱指示植物法)指示植物法檢測(cè)原理是利用植物對(duì)病毒表現(xiàn)出的特異性。早期，生物學(xué)檢測(cè)廣泛應(yīng)用于植物病毒鑒定、病毒株系鑒定等。但在后期使用過(guò)程中，由于對(duì)植株表現(xiàn)出的癥狀沒(méi)有統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)，受人為因素影響很大，而且不同病毒感染同一植株表現(xiàn)出的癥狀極為相似，僅從癥狀無(wú)法區(qū)分病毒。同時(shí)，其檢測(cè)速度慢，時(shí)間長(zhǎng)，成本高。已不能滿足當(dāng)下生產(chǎn)的需求，因此現(xiàn)在研究病毒時(shí)此方法不再作為植物病毒檢測(cè)的主要依據(jù)。

2.2 血清學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)原理是利用病毒與其相對(duì)應(yīng)的抗體在體外可特異性結(jié)合的特性，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、靈敏度高。其檢測(cè)方法多樣，目前最普遍使用的是酶聯(lián)免疫吸附法。大多果樹(shù)病毒都沒(méi)有制備出對(duì)應(yīng)的特異性血清，因此它也很少被用來(lái)檢測(cè)果樹(shù)病毒，而且該方法受季節(jié)性影響較大，不同病毒能感染相似寄主。洪霓等分離和純化很多地區(qū)和寄主的分離物，并制備了單克隆和多克隆抗體。

2.3 分子生物學(xué)鑒定法常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)包括核酸雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)等。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是最常用的病毒檢測(cè)技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。RT-qPCR 是常規(guī)RT-PCR 與熒光信號(hào)收集相結(jié)合的核酸檢測(cè)技術(shù)， 通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的絕對(duì)定量。由于樣品中的病毒含量較低、 病毒序列存在變異性及多糖多酚等抑制物的干擾，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)病毒的難度加大。 秦子禹等分別建立了蘋(píng)果Actin 基因及蘋(píng)果莖溝病毒、莖痘病毒、 褪綠葉斑病毒3 種蘋(píng)果潛隱性病毒的TaqMan 探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研究病毒侵染、增殖、分布以及時(shí)序變化等規(guī)律提供有效的技術(shù)手段。此外，在普通PCR 的基礎(chǔ)上還衍生出環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），該技術(shù)克服了PCR 反應(yīng)需要通過(guò)反復(fù)熱變性這一缺點(diǎn)， 并節(jié)省了反復(fù)升降溫的時(shí)間。 張雙納等利用LAMP 技術(shù)建立了一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)ACLSV 的檢測(cè)方法，為該病毒的田間檢測(cè)和防控提供了更好的技術(shù)支持。

3 蘋(píng)果病毒基因組及遺傳變異

基因組在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)配，導(dǎo)致了遺傳變異的產(chǎn)生。RNA 病毒進(jìn)化變異的方式主要有突變、重組和重排。缺失和插入是導(dǎo)致RNA病毒發(fā)生突變的最主要因素。此外，外界環(huán)境因素如紫外線、化學(xué)誘變劑、高溫環(huán)境等，都會(huì)導(dǎo)致病毒發(fā)生突變。重組是病毒進(jìn)化的一個(gè)主要來(lái)源，可能對(duì)一個(gè)種群的生物特性產(chǎn)生直接影響，例如出現(xiàn)抗病株系，病毒的寄主范圍擴(kuò)大。

近年來(lái)，為了解蘋(píng)果病毒在我國(guó)一些產(chǎn)區(qū)的發(fā)生和變異情況，趙玲玲等檢測(cè)了侵染富士蘋(píng)果的銹果類病毒的分子變異情況，發(fā)現(xiàn)52 條變異序列變異位點(diǎn)主要集中在TL 區(qū)、P 區(qū)和C區(qū)。李正男等擴(kuò)增到蘋(píng)果莖溝病毒吉林沙果分離物全長(zhǎng)基因組，與公布的29 個(gè)ASGV 分離物全基因核苷酸序列一致性為79.20%~86.60%，分離物間沒(méi)有表現(xiàn)出寄主專一性和地理分布規(guī)律；重組分析表明該分離物是蘋(píng)果莖溝病毒黃花梨分離物和柑橘碎葉病毒滿頭紅分離物的重組體。張雙納等成功獲取了ACLSV 遼寧分離物全基因組序列，與已經(jīng)報(bào)道的ACLSV 分離物基因組核苷酸序列的相似性極高，系統(tǒng)發(fā)育分析表明ACLSVXC-HF 分離物位于JB 組，重組分析該分離物為一個(gè)自然重組產(chǎn)物。

4 蘋(píng)果病毒與寄主互作

在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，寄主植物逐漸發(fā)展出一系列對(duì)病毒的免疫機(jī)制，其中包括R 基因介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制、RNA 沉默、凝集素蛋白介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制和其他一些寄主蛋白如一些翻譯起始因子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白等。

開(kāi)展蘋(píng)果病毒與寄主互作研究目的是尋找寄主抗病因子和提高病毒防控水平，為深入了解病毒危害和寄主防御機(jī)制等相關(guān)信息提供了幫助。雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蘋(píng)果病毒生物學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行了許多研究，但目前大部分研究是從病毒本身角度出發(fā)，病毒與寄主互作研究仍存在欠缺。蘋(píng)果病毒侵染嚴(yán)重影響蘋(píng)果植株產(chǎn)量和植物學(xué)性狀，其代謝和基因水平也會(huì)引起相應(yīng)變化。如何乙坤等從ACLSV 鑒別寄主蘇俄蘋(píng)果中篩選到與MP 互作的蛋白，推測(cè)蛋白磷酸酶、病程相關(guān)蛋白及3-磷酸甘油醛脫氫酶3 種功能基因可能參與病毒互作，使蘋(píng)果抵御疾病、響應(yīng)外界壓力以及適應(yīng)不良環(huán)境等方面下降，最終造成植株矮化或生長(zhǎng)衰退等癥狀；崔紅光等研究發(fā)現(xiàn)PNRSV 可以通過(guò)3’端病毒基因組構(gòu)象的改變調(diào)控病毒與結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)控病毒的復(fù)制、翻譯和侵染，產(chǎn)生輕微斑駁和嚴(yán)重皺縮花葉（扭曲、穿孔和耳突）等癥狀。

5 蘋(píng)果病毒侵染性cDNA 克隆構(gòu)建及致病性分析

植物病毒侵染性全長(zhǎng)cDNA 克隆構(gòu)建是在DNA 水平上研究RNA 病毒便利的工具，有助于開(kāi)展RNA 病毒分子特性和生物學(xué)特性研究。利用構(gòu)建的侵染性cDNA 克隆或通過(guò)對(duì)侵染性cDNA 克隆進(jìn)行堿基突變、插入、缺失、重組或重排等操作，研究RNA 病毒的復(fù)制、運(yùn)動(dòng)、致病區(qū)域、關(guān)鍵致病位點(diǎn)、蛋白功能、寄主范圍及與寄主的互作作用等。國(guó)內(nèi)外雖然已經(jīng)報(bào)道了多種植物病毒侵染性克隆的成功構(gòu)建，但是植物病毒全長(zhǎng)性的侵染性cDNA 克隆構(gòu)建技術(shù)性較強(qiáng)，構(gòu)建工作仍然存在困難。

蘋(píng)果壞死花葉病毒是在蘋(píng)果花葉樣品中鑒定出的一種新的植物病毒，為單鏈正義RNA 病毒，其基因組結(jié)構(gòu)為3 分體，包括RNA1、RNA2和RNA3。 邢飛等借助雙元植物表達(dá)載體pCase-Rz，構(gòu)建了APNMV 的全長(zhǎng)cDNA 克隆，成功驗(yàn)證了其生物學(xué)活性。并通過(guò)與APMV 在模式植物黃瓜上的接種癥狀進(jìn)行比較研究，說(shuō)明APNMV 和APMV 致病的一致性， 推測(cè)APNMV 在自然寄主蘋(píng)果上引起的癥狀與APMV 類似，為APNMV 能夠引起蘋(píng)果花葉病提供了進(jìn)一步的證據(jù)。張雙納等構(gòu)建了ACLSV侵染性克隆，在西方煙上接種ACLSV 后出現(xiàn)了葉片黃化褪綠的癥狀。

6 蘋(píng)果病毒防控技術(shù)和脫除技術(shù)

與真菌和細(xì)菌病害相比，尚無(wú)有效的化學(xué)藥劑或生物制品對(duì)蘋(píng)果病毒病進(jìn)行有效的防治。目前國(guó)際上廣泛使用的防治方式是建立無(wú)病毒的母本園，培育種植無(wú)病毒苗木。澳大利亞建立了嚴(yán)格的海關(guān)檢疫制度， 針對(duì)蘋(píng)果上的3 種細(xì)菌、21 種真菌、2 種植原體、4 種類病毒、3 種病毒，特別采用了常規(guī)生物學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行入境前檢疫。 我國(guó)對(duì)蘋(píng)果病毒病的研究起步較晚， 直至20 世紀(jì)80 年代，我國(guó)才正式對(duì)蘋(píng)果病毒病的系統(tǒng)化研究。王韋驍?shù)妊芯靠偨Y(jié)出了蘋(píng)果樹(shù)病毒病立體綜合防控技術(shù)規(guī)程：病樹(shù)分類、分級(jí)隔離區(qū)別管理、合理修剪、剪鋸消毒、合理肥水、優(yōu)化土壤微生物結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)，地下土壤、根系、樹(shù)干、樹(shù)上立體防治。

在蘋(píng)果病毒脫除技術(shù)方面，采用的方法主要有熱處理、莖尖培養(yǎng)、熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合、微體嫁接、培育花藥、超低溫與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合等。王李芳等利用病毒檢測(cè)、病毒脫除、組培快繁等技術(shù)得到‘伊美’‘魔笛’‘中秋王’‘玉華早富’4 個(gè)蘋(píng)果新優(yōu)品種的無(wú)病毒苗木。楊艷敏等以‘馬克9’‘遼砧2 號(hào)’‘GM256’3 個(gè)遼寧地區(qū)常用的蘋(píng)果矮化砧木品種為試材， 研究了蘋(píng)果矮化砧木組織培養(yǎng)及試管苗熱處理脫病毒技術(shù)建立無(wú)病毒蘋(píng)果矮化砧木苗快繁體系。 李艷林等研究出新型莖尖超低溫脫毒技術(shù)體系， 并成功脫除蘋(píng)果病毒ACLSV 和ApMV。

7 問(wèn)題與展望

蘋(píng)果病毒病嚴(yán)重制約了蘋(píng)果的生產(chǎn)發(fā)展，最根本的解決途徑是建立規(guī)范的無(wú)病毒苗木繁育體系。目前國(guó)內(nèi)外大部分研究是從病毒本身出發(fā)，明確了該病毒的癥狀危害、檢測(cè)方法和傳播途徑，但病毒所編碼蛋白的功能作用，病毒在植物體內(nèi)如何復(fù)制增殖、如何運(yùn)動(dòng)，寄主互作研究及病原與病毒的致病性等作用機(jī)制方面的研究存在欠缺。今后，加強(qiáng)對(duì)蘋(píng)果病毒病的致病機(jī)制研究，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與病毒互作的寄主因子研究以及病毒侵染性cDNA 克隆的構(gòu)建會(huì)成為一個(gè)主要研究方向。