一株B 型副雞嗜血桿菌的分離與鑒定

劉龍英

（山東省博興縣畜牧獸醫(yī)局山東濱州256500）

副雞嗜血桿菌是雞傳染性鼻炎的致病菌，該菌感染雞后可引起急性或亞急性上呼吸道傳染病，臨床上該病菌潛伏期短、傳播速度快、發(fā)病率高，且常與其它致病微生物一起引發(fā)混合感染，造成嚴重的經(jīng)濟損失。自2018 年6 月份以來，山東濱州博興某養(yǎng)雞場陸續(xù)發(fā)生蛋雞產(chǎn)蛋迅速降低、打噴嚏、鼻孔流出黏液性或膿性分泌物等癥狀，嚴重者出現(xiàn)顏面腫脹、生長停滯等臨床表現(xiàn)，每天發(fā)病雞不斷增多，但死亡雞6～10 只/d 不等；通過到雞場現(xiàn)場調(diào)研、采樣、實驗室分離鑒定等，最終確診雞群感染副雞嗜血桿菌，并指導該雞場采用有效藥物開展治療及加強免疫等，疫情得到了有效控制。現(xiàn)將實驗室分離鑒定等工作總結(jié)如下。

1 病料采集

從發(fā)病雞場將病死雞取頭或直接制備眶下竇棉拭子后，冷藏送至實驗室進行分離研究。

2 細菌分離培養(yǎng)

將病死的雞頭病料消毒處理后，在無菌條件下，剪開眶下竇，用經(jīng)火焰滅菌并冷卻的接種環(huán)取眶下竇內(nèi)液體或?qū)⒖粝赂]棉拭子分別接種于馬丁肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和含5%雞血清及氧化型輔酶（NAD）的副雞嗜血桿菌固體培養(yǎng)基上進行細菌分離培養(yǎng)，37℃微需氧條件下培養(yǎng)24～48h。結(jié)果馬丁肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基沒有細菌生長，而在含血副雞嗜血桿菌固體培養(yǎng)基表面可見不溶血的邊緣整齊、透明、輕微凸起、針狀、細小的菌落，與副雞嗜血桿菌相似。

3 染色鏡檢

挑取典型的疑似副雞嗜血桿菌涂片后，進行革蘭氏染色，鏡檢可見該分離菌株為兩極濃染、無芽胞、無莢膜、無鞭毛的革蘭氏陰性小桿菌，與副雞嗜血桿菌相似。

4 PCR 法鑒定與分型

分別應(yīng)用已經(jīng)合成的副雞嗜血桿菌鑒定引物和分型引物進行PCR 鑒定，鑒定引物上游序列為5'-GATGGCACAATTACATTTACA-3'，下游序列為5'-ACCTTGAGTGCTAGATGCTGTAGGTGC-3'，擴增目的條帶大小為1600bp；A、B、C 型副雞嗜血桿菌共用上游序列為5'-GCTCACAGCTTTATGCAACGAA-3'，A 型下游序列為5'-CGCGGGATTGTTGATTTTGTT-3'，擴增目的條帶大小為800bp；B 型 下 游 序 列 為5'-GGTGAATTTCACCACACCAC-3'，擴增目的條帶為1100bp；C 型下游序列為5'-TAATTTTCTTATTCCCAGCATCAATACCAT-3'，擴增目的條帶大小為1600bp；首先將疑似副雞嗜血桿菌菌落取單菌落加到100μL 滅菌水中，煮沸約10min 后離心取上清當做模板，鑒定PCR 反應(yīng)體系為：上下游引物各1μL、模板1μL、PCR mix 12.5μL，補滅菌水至25μL，同時設(shè)立陰性對照；分型PCR 反應(yīng)體系為上游引物和ABC 三型下游引物各1μL、模板1μL、PCR mix 12.5μL，補滅菌水至25μL，同時設(shè)立陽性對照；反應(yīng)條件分別為98℃預(yù)變性1min，98℃變性10s，鑒定退火溫度為55℃、10s，分型退火溫度為56℃、10s，，72℃延伸2min，共30 循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠板電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外投射儀上打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進行成像分析，結(jié)果與預(yù)期相符。

5 動物回歸試驗

將分離菌進行純化后，稀釋至50 萬/0.2mL，通過竇內(nèi)途徑接種易感雞，接種后48h 內(nèi)全部發(fā)病。

6 藥敏試驗

將分離菌純化后，進行常規(guī)藥物的藥敏試驗，將強力霉素、慶大霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、大觀霉素、頭孢噻呋鈉、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉共9 種藥敏片均勻貼在接種分離菌的平板上，37℃微需氧條件下培養(yǎng)24～48h。結(jié)果該分離菌株除對大觀霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉呈中度敏感外，其余7 種均不敏感耐藥。

7 小結(jié)

通過結(jié)合臨床癥狀及實驗室一系列的檢驗等實際情況，可確診該發(fā)病雞群感染了B 型副雞嗜血桿菌。參考此次藥敏試驗的結(jié)果，建議該雞場采用大觀霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉聯(lián)合用藥進行治療，治療后疫情有效控制，病雞好轉(zhuǎn)，成年蛋雞產(chǎn)蛋率逐漸恢復(fù)正常，無新發(fā)病例和死亡病例出現(xiàn)。隨后對整個雞群進行了疫苗強化免疫。研究發(fā)現(xiàn)副雞嗜血桿菌可分為A、B、C 三種血清型，且各型之間沒有交叉保護，此次疫情分析其原因是由于本地區(qū)一直流行由A 型副雞嗜血桿菌引發(fā)的鼻炎，因此該場定期免疫雞傳染性鼻炎（A 型）滅活疫苗，而該疫苗對其他型鼻炎沒有交叉保護的能力，當流行株發(fā)生改變時，不能發(fā)揮保護能力進而造成雞群發(fā)病的情況。

副雞嗜血桿菌極易感染育成雞和蛋雞而發(fā)病，且傳染性極強，能夠迅速蔓延至整個雞群，因此一旦發(fā)病將給養(yǎng)雞業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失，所造成的經(jīng)濟損失大小與養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理水平高低及有無繼發(fā)感染等眾多因素密切相關(guān)。當前疫苗免疫是防治副雞嗜血桿菌感染的根本措施，適時接種合適的疫苗能夠有效的預(yù)防雞傳染性鼻炎病的發(fā)生，目前雞傳染性鼻炎（A 型）滅活疫苗應(yīng)用較為廣泛，但鑒于A 型和C 型雞傳染性鼻炎流行趨勢日益突出，臨床上也多選用雞傳染性鼻炎（A 型+C 型）、新城疫二聯(lián)滅活疫苗進行全面預(yù)防，無論是種雞還是蛋雞每年需免疫兩次疫苗。鑒于近年來B 型副雞嗜血桿菌分離株不斷出現(xiàn)，故在日常預(yù)防時應(yīng)加強A、B、C 三型同時免疫，真正發(fā)揮疫苗的保護作用。除嚴格防疫外，副雞嗜血桿菌感染的發(fā)生常與應(yīng)激、飼養(yǎng)管理等誘因密切相關(guān)，因此養(yǎng)殖場應(yīng)注重加強日常飼養(yǎng)管理。保持環(huán)境的衛(wèi)生清潔和舍內(nèi)良好的衛(wèi)生條件，定期消毒，保證雞舍適宜的溫度，平時要加強舍內(nèi)通風換氣，保證供給優(yōu)質(zhì)全價的飼料，季節(jié)交替等關(guān)鍵時期更應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，增強雞群抵抗疾病的能力。從根源杜絕病原菌的侵入，外購引進雛雞或種雞時必須嚴格檢疫。同時養(yǎng)雞場應(yīng)結(jié)合本場或本區(qū)疫病的實際情況有計劃的開展預(yù)防性投藥。一旦發(fā)病疑似病例應(yīng)盡早治療，抗生素類藥物和磺胺類藥物仍是治療雞傳染性鼻炎的重要手段，但應(yīng)避免長期使用一種或錯用濫用抗生素等，防止耐藥性的產(chǎn)生。█