益生菌發(fā)酵蘋果汁過程中總酚酸變化與動力學研究

高振鵬 宋 楊 張美娜 韓夢珍 岳田利

(1.西北農林科技大學食品科學與工程學院， 陜西楊凌 712100；2.農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室(楊凌)， 陜西楊凌 712100)

0 引言

蘋果富含多酚，蘋果多酚以游離態(tài)及結合態(tài)的形式存在，具有抗氧化及預防心血管疾病等作用[1-2]。酚酸(對羥基苯甲酸或對羥基肉桂酸衍生物)是多酚的一種，在植物中主要以共價鍵的形式存在。使結合態(tài)多酚(包括酚酸)轉變?yōu)橛坞x態(tài)多酚以產生更大的功效，是目前的研究方向。另外，蘋果加工產品急需升級，功能化加工是未來果蔬加工的發(fā)展方向之一。益生菌具有調節(jié)人體腸道菌群平衡及抗腫瘤等[3-7]多重功能。通過益生菌發(fā)酵蘋果汁，既使蘋果汁含有益生菌，又可使蘋果汁中結合態(tài)多酚變?yōu)橛坞x態(tài)多酚，增加了蘋果汁中功能成分含量。

蘋果汁營養(yǎng)物質豐富，是益生菌發(fā)酵的良好載體。目前，大部分研究圍繞蘋果汁發(fā)酵工藝、菌種篩選及發(fā)酵前后風味變化展開[8-10]，對發(fā)酵過程中功能物質的變化研究較少。動力學模型能夠對微生物發(fā)酵過程進行準確預測[11-13]，有助于優(yōu)化發(fā)酵工藝，對于擴大工業(yè)化生產具有重要意義。微生物的種類繁多，發(fā)酵物質變化復雜。目前，尚未見混菌發(fā)酵使蘋果汁中結合態(tài)酚酸變?yōu)橛坞x態(tài)酚酸的動力學及其模型構建方面的研究報道。

本文以復合蘋果汁為原料，利用植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌及嗜酸乳桿菌協(xié)同發(fā)酵，對蘋果汁發(fā)酵過程中總酚酸及單體物質含量進行動態(tài)分析，探究其變化趨勢，構建混菌發(fā)酵蘋果汁中菌體生長及總酚酸變化動力學模型，旨在為開發(fā)功能蘋果汁產品及其產業(yè)化提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌6005(Lactobacillusacidophilus)、植物乳桿菌21805(Lactobacillusplants)、發(fā)酵乳桿菌21828(Lactobacillusfermentum)，均保存于西北農林科技大學食品科學與工程學院健康食品制造與安全控制實驗室；阿克蘇蘋果、秦冠蘋果、澳洲青蘋果，均購于陜西省楊凌區(qū)當?shù)厥袌?；MRS培養(yǎng)基(乳酸細菌培養(yǎng)基)，北京奧博星生物技術有限責任公司；兒茶素(色譜純)，上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜純)， 美國TEDIA公司；沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、肉桂酸、對羥基苯甲酸(純度98%以上)，上海源葉生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GP2000-2型榨汁機，南通金橙機械有限公司；HSQ-1型恒溫水浴鍋，上海智城分析儀器有限公司；ZX-35B1型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BCN-1306B型超凈工作臺，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；ZXSD-A1160型恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；LC-15C型高效液相色譜儀，日本島津公司；UV-1700型紫外可見分光光度計，日本島津公司；RE-5205型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1蘋果汁制備

制備工藝為：蘋果挑選→清洗→切塊→榨汁→酶解(45℃，2 h)→抽濾→復配(阿克蘇蘋果、秦冠蘋果與澳洲青蘋果體積比為4∶3∶1)→-18℃冷凍待用。

1.3.2蘋果汁發(fā)酵

將保存于甘油管中的3株菌分別置于MRS液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)2次，當?shù)?次擴大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中菌體濃度達到9.0 lg CFU/mL時備用。將活化好的發(fā)酵劑(菌體濃度9.0 lg CFU/mL)在8 000 r/min的轉速下離心10 min，棄上清液，用滅菌后的復合蘋果汁重新懸浮[14]。將重懸后的益生菌按照嗜酸乳桿菌6005、植物乳桿菌21805與發(fā)酵乳桿菌21828的體積比1∶1∶1，以3%的接種量接入復合蘋果汁中，36℃下靜置發(fā)酵24 h，期間定時取樣。

1.3.3活菌數(shù)及理化指標測定

活菌數(shù)采用傾注平板計數(shù)法(GB 4789.35—2016)測定；可滴定酸含量采用酸堿滴定法(GB/T 15038—2006)測定；總糖含量采用斐林試劑滴定法(GB/T 15038—2006)測定。總黃酮含量采用氯化鋁法測定[15]：以兒茶素質量濃度(mg/L)為橫坐標，510 nm處的吸光度為縱坐標，得到的標準曲線方程為y=0.034 4x-0.003 6，R2=0.999 9；總酚酸含量采用FeCl3-K3[Fe(CN)6]比色法測定[16]：以沒食子酸質量濃度(mg/L)為橫坐標，720 nm處的吸光度為縱坐標，得到的標準曲線方程為y=0.491 9x+0.004 4，R2=0.994 8。

1.3.4多酚單體含量測定

多酚單體含量測定采用高效液相色譜法[17]，略有修改。

樣品處理：取20 mL發(fā)酵蘋果汁，并用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至7.0，每次用20 mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，用1 mol/L鹽酸溶液調節(jié)剩余發(fā)酵蘋果汁的pH值至2.0，再每次用20 mL乙酸乙酯萃取3次。合并萃取得到的酚提取液，35℃下旋轉蒸發(fā)至干燥，用10 mL甲醇溶解干物質，經0.22 μm有機系濾膜過濾備用。

色譜條件：采用Agilent 5 TC C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為2%乙酸水溶液，流動相B為含0.5%乙酸的乙睛-水溶液(體積比1∶1)；梯度洗脫程序：流動相B的體積分數(shù)在0～50 min，由10%增到55%，在50～60 min，由55%增到100%，在60～65 min，遞減到10%，在此體積分數(shù)下平衡10 min；柱溫：30℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL。檢測器：紫外吸收檢測器；檢測波長：對羥基苯甲酸、扁蓄苷為254 nm，肉桂酸為260 nm，沒食子酸、原花青素B2、原花青素C1、表兒茶素、根皮苷、根皮素為280 nm，綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁為360 nm。

1.4 動力學研究

通過優(yōu)化得到發(fā)酵條件為接種量1.8%，發(fā)酵溫度37℃，在此條件下進行動力學研究，每隔1 h測定菌體生物量及總酚酸含量，建立菌體生長及總酚酸變化模型并驗證，預測發(fā)酵過程變化。

1.4.1菌體生物量測定

將發(fā)酵蘋果清汁稀釋后于600 nm波長下測定吸光度。菌體光密度(OD值)為OD讀數(shù)與稀釋倍數(shù)的乘積。

1.4.2菌體生長動力學模型

Logistic方程是用來描述發(fā)酵過程中菌體生長量隨時間變化規(guī)律最常用的模型，是典型的“S”形曲線。研究發(fā)現(xiàn)，混合菌株發(fā)酵蘋果汁符合這一規(guī)律，因此采用Logistic方程[18]對發(fā)酵過程進行研究。

1.4.3總酚酸變化動力學模型

總酚酸變化與菌體生長變化趨勢相似，將蘋果汁發(fā)酵過程中總酚酸與菌體OD值進行線性制圖，二者呈線性關系，說明總酚酸含量的增加與菌體生長相關聯(lián)。通過Logistic、Sgompertz和Boltzmann方程[19]分別建立總酚酸變化動力學模型，通過比較模型相關系數(shù)確定最終總酚酸變化模型[20-21]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3次，利用Microsoft Office Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行計算；利用SPSS 20.0軟件進行方差顯著性分析；利用Origin 2018軟件繪圖及模型擬合驗證。

2 結果與討論

2.1 活菌數(shù)、總糖及可滴定酸含量

對益生菌發(fā)酵蘋果汁發(fā)酵過程中的活菌數(shù)、總糖及可滴定酸含量進行動態(tài)監(jiān)測，繪制曲線，結果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵過程中活菌數(shù)、總糖及可滴定酸含量的變化曲線Fig.1 Changes of viable count, total sugar and titratable acid during fermentation process

由圖1可知，4 h后蘋果汁中益生菌進入對數(shù)生長期，生長繁殖速度明顯加快，活菌數(shù)迅速增加。此后，隨著發(fā)酵的進行，營養(yǎng)物質消耗，代謝產物不斷積累，益生菌的繁殖速度逐漸下降。16 h后益生菌繁殖進入穩(wěn)定期，24 h發(fā)酵結束時，活菌數(shù)基本保持穩(wěn)定，即活菌菌體濃度為2.68×108CFU/mL。益生菌維持自身生長和繁殖都需要糖代謝供能，發(fā)酵初始蘋果汁中總糖質量濃度為12.74 g/(100 mL)，可滴定酸質量濃度為2.97 g/L。接種后，益生菌利用蘋果汁中的可發(fā)酵糖，將其轉化為酸。隨著益生菌發(fā)酵蘋果汁發(fā)酵過程的進行，蘋果汁中總糖含量呈下降趨勢，可滴定酸含量呈上升趨勢。發(fā)酵結束時，總糖質量濃度下降至10.25 g/(100 mL)，可滴定酸質量濃度增加到5.04 g/L。

2.2 總黃酮及總酚酸含量

對益生菌發(fā)酵蘋果汁發(fā)酵過程中的總黃酮及總酚酸含量進行動態(tài)監(jiān)測，結果如圖2所示。

由圖2可知，益生菌發(fā)酵蘋果汁初期，蘋果汁中總黃酮質量濃度為218.73 mg/L，16 h時達到220.54 mg/L，隨后開始下降，24 h時降為210.49 mg/L。發(fā)酵過程中蘋果汁中總酚酸含量總體呈上升趨勢，初始發(fā)酵時，總酚酸質量濃度為142.96 mg/L，隨后不斷上升，16 h時達到204.06 mg/L，發(fā)酵后期總酚酸含量基本趨于穩(wěn)定。多酚是一大類物質，根據(jù)酚環(huán)數(shù)量和彼此結合的結構分為酚酸、類黃酮、芪和木質素[22]。由于酚酸在植物中主要以共價鍵的形式存在，發(fā)酵過程引起蘋果汁中酚酸類物質含量變化的原因很多，部分原因是微生物分解共價鍵結合的大分子酚酸物質為小分子酚酸物質，使其含量升高，也可能是由于膳食結合態(tài)酚酸能被微生物利用轉化為游離態(tài)酚酸所致[23-24]。

2.3 酚酸類單體含量

在蘋果汁發(fā)酵過程中，對蘋果汁中7種酚酸類單體含量進行動態(tài)分析，結果如表1所示。

表1 發(fā)酵過程中酚酸類多酚單體質量濃度的變化Tab.1 Changes of phenolic polyphenols content during fermentation process mg/L

由表1可知，7種酚酸類單體成分中，綠原酸含量最高，初始發(fā)酵時質量濃度為89.10 mg/L，隨著發(fā)酵的進行，其含量不斷變化，20 h時達到最大值，質量濃度為112.53 mg/L，隨后稍有下降，24 h時綠原酸質量濃度為106.69 mg/L，比初始發(fā)酵時增加了19.74%，發(fā)酵之后綠原酸含量顯著升高(p<0.05)。初始發(fā)酵時沒食子酸質量濃度為0.74 mg/L，12 h時質量濃度達到1.84 mg/L，24 h發(fā)酵結束時沒食子酸質量濃度為1.73 mg/L，是初始發(fā)酵時的2.34倍，發(fā)酵前后含量差異顯著(p<0.05)，主要是聚合單寧水解可以生成沒食子酸[25]。另外，在發(fā)酵過程中對羥基苯甲酸含量及阿魏酸含量變化差異不顯著，其中阿魏酸是微生物合成多種香氣成分的前體物質[26]?？Х人?、對香豆酸及肉桂醛的含量總體呈現(xiàn)下降趨勢，發(fā)酵前后含量變化差異顯著(p<0.05)。

2.4 益生菌發(fā)酵蘋果汁動力學研究

2.4.1菌體生長及總酚酸含量變化動力學曲線

在益生菌發(fā)酵蘋果汁過程中，隨發(fā)酵的進行，菌體OD值及總酚酸含量也在發(fā)生變化，結果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵蘋果汁動力學曲線Fig.3 Kinetics curves of fermented apple juice

由圖3可知，3 h后蘋果汁中益生菌繁殖進入對數(shù)生長期，菌體生長迅速，大量繁殖，17 h后菌體生長速度減緩，菌體數(shù)量趨于平穩(wěn)，進入穩(wěn)定期。總酚酸含量變化趨勢與菌體生長曲線趨勢基本一致。

2.4.2菌體生長動力學模型的建立

Logistic方程[18]為

(1)

式中x——菌體的OD值

t——發(fā)酵時間,h

μm——比生長速率的最大值，h-1

xm——發(fā)酵過程菌體的最大OD值，其不隨基質濃度變化而改變

當t=0時，x=x0(菌體的初始OD值)為初始條件，式(1)積分變形為

(2)

菌體的最大OD值xm=1.318，根據(jù)不同時間菌體量的試驗數(shù)據(jù)，用Origin軟件進行非線性擬合，經過運算得到x0=0.319 7，μm=0.247 1 h-1。

將x0、xm、μm代入式(2)得到菌體生長動力學模型為

(3)

2.4.3總酚酸變化動力學模型的建立

為了研究益生菌發(fā)酵過程中總酚酸變化動力學過程，利用Logistic、Sgompertz和Boltzmann模型[19]對試驗數(shù)據(jù)進行擬合，確定最佳的總酚酸變化動力學模型方程，各模型擬合方程及其決定系數(shù)見表2，P表示總酚酸增加量。

表2 總酚酸增加量擬合方程及其決定系數(shù)Tab.2 Fitting equations and its determination coefficients for total phenolic acid increment

由表2可知，對比益生菌發(fā)酵過程總酚酸變化動力學方程Logistic、Sgompertz和Boltzmann建立的3個擬合方程的決定系數(shù)，相關性均較高，其中，Boltzmann模型擬合效果最好，其決定系數(shù)R2為0.991 5，說明Boltzmann模型能夠更好地描述益生菌發(fā)酵過程總酚酸變化，因此，本研究選取Boltzmann模型方程為益生菌發(fā)酵過程總酚酸變化動力學最佳模型。

2.4.4模型驗證

為了檢驗建立的菌體生長動力學模型和總酚酸變化動力學模型的可靠性，對動力學模型的理論值與試驗數(shù)據(jù)實測值進行比較，結果如圖4、5所示，對模型進行方差分析，結果如表3所示。

圖4 菌體生長模型擬合曲線Fig.4 Fitting curve of microbial growth kinetics model

圖5 總酚酸增加量變化模型擬合曲線Fig.5 Fitting curve of total phenolic acid increment model

由圖4、5可知，菌體生長模型和總酚酸變化模型方程計算理論值(擬合值)與試驗數(shù)據(jù)實測值符合較好，可以用上述兩個方程作為菌體生長及總酚酸增加量變化的模型。由表3可知，菌體生

表3 發(fā)酵動力學模型方差分析Tab.3 ANOVA for fermentation kinetic model

長模型和總酚酸增加量變化模型的決定系數(shù)分別為0.993 9和0.991 5，模型擬合程度很高，說明模型能夠很好地預測益生菌發(fā)酵蘋果汁過程中菌體生長和總酚酸變化過程。

為進一步驗證模型可靠性，對益生菌發(fā)酵蘋果汁過程中的發(fā)酵試驗值和模型理論值進行比較，結果如表4所示。

由表4可知，菌體生長模型理論值和試驗值的平均誤差為2.64%，總酚酸增加量變化模型理論值和試驗值的平均誤差為5.97%，均小于10%，說明模型擬合度高，能夠很好地描述發(fā)酵過程的變化規(guī)律。

3 結論

(1)利用嗜酸乳桿菌6005、植物乳桿菌21805和發(fā)酵乳桿菌21828混菌發(fā)酵由阿克蘇蘋果、秦冠蘋果和澳洲青蘋果3個品種復合的蘋果汁，發(fā)酵過程中活菌菌體濃度達到2.68×108CFU/mL，總糖含量下降，可滴定酸含量上升，總酚酸含量總體呈上升趨勢，16 h時總酚酸含量達到最大值，各多酚單體中綠原酸及沒食子酸等功能性酚酸類多酚單體含量增加。

表4 動力學模型試驗值與理論值的比較Tab.4 Comparison of experimental and calculated data of kinetic model

(2)對益生菌發(fā)酵蘋果汁進行動力學研究，建立了菌體生長動力學模型和總酚酸含量變化動力學模型并加以驗證，決定系數(shù)分別為0.993 9和0.991 5，試驗值與理論值的平均誤差均小于10%，說明建立的模型可以很好地描述發(fā)酵過程，預測發(fā)酵中酚酸的變化過程。