獼猴桃葉枯病病原菌廣譜拮抗菌株的篩選與鑒定

付 博，王家哲，張 鋒，李英梅，任 平,2

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所 有害生物監(jiān)測(cè)與防控研究中心，陜西 西安 710043；2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710600)

陜西省是我國的獼猴桃種植大省，隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，獼猴桃病害也不斷加重。近年來獼猴桃細(xì)菌性葉枯病成為新興的獼猴桃主要病害，研究發(fā)現(xiàn)其病原菌為丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonassyringaepv.Syringae)，該病主要危害獼猴桃葉片，輕時(shí)個(gè)別葉片表現(xiàn)出局部枯死癥狀， 重時(shí)則大部分葉片干枯死亡，嚴(yán)重影響果樹的生長及果實(shí)的品質(zhì)[1, 2]。

傳統(tǒng)的獼猴桃葉枯病防治主要采用化學(xué)藥物防治，但由于生產(chǎn)過程中長期大量使用化肥、農(nóng)藥，果園生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重惡化，果樹營養(yǎng)供給不足，果樹自身對(duì)各種病蟲害的抗性能力減弱，產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的污染日漸嚴(yán)重，并影響了獼猴桃的生產(chǎn)、產(chǎn)品外銷、威脅人的健康和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。近年來國內(nèi)外積極探索并采用以微生物為主要拮抗物質(zhì)進(jìn)行植物病害防治，通過菌體和植物病害之間的相互作用研究證明了應(yīng)用生物防治技術(shù)保護(hù)重要經(jīng)濟(jì)作物是十分可行的，此外生物防治采用微生物菌株作為拮抗物質(zhì)，具有可擴(kuò)大培養(yǎng)、節(jié)約經(jīng)濟(jì)和沒有副作用的優(yōu)點(diǎn)[4]。

用于植物病害防治的拮抗微生物種類較多，包括放線菌[5]、芽孢桿菌和假單胞菌等，而由于芽孢桿菌自身能夠產(chǎn)生耐高溫、耐酸堿，抗逆性極強(qiáng)的芽孢而受到廣泛關(guān)注并作為生防菌劑被大量投放到實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中[6, 7]。目前已分離鑒定出來的對(duì)獼猴桃葉枯病有拮抗作用的菌種仍十分有限，而且現(xiàn)有菌種的抗病能力良莠不齊，因此，本研究擬從獼猴桃根際土壤中篩選出對(duì)獼猴桃葉枯病具有廣譜拮抗作用并且抗性較強(qiáng)的芽孢桿菌并對(duì)其進(jìn)行鑒定。從而不斷豐富現(xiàn)有的拮抗菌株資源，積極促進(jìn)生物防治技術(shù)在提高獼猴桃樹防病、抗病能力方面發(fā)揮更大的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 按常規(guī)方法采集陜西眉縣、周至縣和西安臨潼區(qū)獼猴桃園果樹根際土壤。

1.1.2 供試病原菌 獼猴桃細(xì)菌性病原菌，丁香假單胞菌丁香致病變種(編號(hào)1336)(Pseudomonassyringaepv.Syringae)，獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌(編號(hào)2102)(Pseudomonassyringaepv.actinidae)，菌種來源：購于中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所。植物常見真菌性病原菌，獼猴桃灰霉病病原菌F3(Botrytiscinerea)、黃瓜枯萎病病原菌F5(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、甜瓜枯萎病病原菌F7(Fusarimaxysporiumf.sp.melonis)、蘋果斑點(diǎn)落葉病病原菌F9(Alternariaalternataf.sp.Mali)、辣椒疫病病原菌F11(Phytophthoracapsici)菌種來源：由西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室友情饋贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑和儀器 PCR所用Buffer、dNTP、Taq酶等購自北京鼎國生物技術(shù)公司，限制性內(nèi)切酶EcoR I 購自Takara公司，克隆載體pGEM-T Easy購自Promega公司，氨芐青霉素(Amp)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、瓊脂糖等購自Wolsen公司，細(xì)菌基因組DNA提取、質(zhì)粒提取、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自Biotake公司，其他常規(guī)實(shí)際均為國產(chǎn)分析純。離心機(jī)Centrifuge5415D、Centrifuge5810R、pCR儀、微量可調(diào)移液器、電轉(zhuǎn)化儀 Eleetroporator2510均購自Eppendorf公司，DNA mini購自Heto-Holten公司，凝膠成像系統(tǒng)購自SYNGENE公司，電泳儀購自Bio-RAD公司，恒溫?fù)u床、培養(yǎng)箱、水浴鍋等均為國產(chǎn)儀器。

1.2 菌株分離和篩選

1.2.1 根際土壤中芽孢桿菌的分離篩選 土樣經(jīng)室溫干燥后稱取25 g放入225 mL含有少量玻璃珠的無菌水振蕩30 min，樣品懸液經(jīng)80 ℃水浴加熱20 min，取0.1 mL稀釋涂布牛肉膏蛋白胨平板，30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落劃線、編號(hào)保藏備用。

1.2.2 具有拮抗作用的菌種初篩 以獼猴桃葉枯病病原菌為拮抗對(duì)象，采用抑菌圈法[2]，每個(gè)待篩菌株4個(gè)重復(fù)，并利用SPSS軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)分析[8]。

1.2.3 具有拮抗作用的菌種復(fù)篩 為進(jìn)一步確定無菌發(fā)酵液上清對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌的拮抗作用，搖瓶發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，取上清，采用細(xì)菌過濾器(0.22 μm)過濾除菌，制備無菌的發(fā)酵液上清，采用牛津杯法進(jìn)行復(fù)篩，每個(gè)待測(cè)菌株設(shè)置4組重復(fù)，測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值[2, 9]。

1.2.4 拮抗菌的抑菌譜檢測(cè) 以最常見的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)為檢測(cè)對(duì)象，采用抑菌圈法檢測(cè)菌株拮抗效果；以獼猴桃灰霉病病原菌F3(Botrytiscinerea)、黃瓜枯萎病病原菌F5(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、甜瓜枯萎病病原菌F7(Fusarimaxysporiumf.sp.melonis)、蘋果斑點(diǎn)落葉病病原菌F9(Alternariaalternataf.sp.Mali)、辣椒疫病病原菌F11(Phytophthoracapsici)5種常見的植物真菌性病害為檢測(cè)對(duì)象，采用平板對(duì)峙法檢測(cè)菌株拮抗效果，30 ℃培養(yǎng)5 d，測(cè)量真菌圓形菌落邊緣為起止的直徑，以未接拮抗菌的真菌平板為對(duì)照，計(jì)算抑菌率[2, 10]。

抑制菌=

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌體形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn) 篩選出對(duì)獼猴桃葉枯病具有廣譜拮抗作用的菌株并參照文獻(xiàn)[11]方法觀察菌體形態(tài)并測(cè)定生理生化特征。

1.3.2 16S rDNA序列測(cè)定 使用Biotake細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提菌體基因組DNA，采用細(xì)菌鑒定通用引物27F(正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1492R(反向引物：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min、57.5 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用Biotake柱式DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠純化。切膠純化產(chǎn)物連接pGEM-T Easy載體，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白篩選得到陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行EcoR I單酶切驗(yàn)證，將質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序，序列提交NCBI網(wǎng)站獲得GenBank登陸號(hào)[12-13]。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將菌株16S rDNA序列通過BLAST與NCBI網(wǎng)站GenBank中已知的序列進(jìn)行同源性分析，利用DNASTAR(MegAlign)將序列進(jìn)行對(duì)位排列，并手工適當(dāng)校正，MEGA3.1分析堿基組成，并以Kimura22參數(shù)計(jì)算遺傳距離，采用Nj鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)獼猴桃葉枯病有拮抗作用的芽孢桿菌初篩

按上述方法，從獼猴桃根際土壤中共分離出31株對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌(編號(hào)1336)有拮抗作用的芽孢桿菌，其中抑菌圈直徑大于0.5 cm占總數(shù)的82%(圖1)。

圖1 菌株MX3-11對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌的拮抗作用

2.2 對(duì)獼猴桃葉枯病有拮抗作用的芽孢桿菌的復(fù)篩

以初篩的對(duì)葉枯病病原菌(編號(hào)1336)有拮抗作用的31株芽孢桿菌為研究對(duì)象，檢測(cè)拮抗菌株的發(fā)酵液上清對(duì)致病菌的抑制作用。結(jié)果顯示，初篩的拮抗菌中有3株菌MX3-11、TJKB-24和NF2的無菌發(fā)酵液上清對(duì)葉枯病病原菌(編號(hào)1336)具有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均>0.5 cm(表1)。

表1 發(fā)酵液上清對(duì)病原菌的抑制作用

2.3 菌株抑菌譜檢測(cè)

采用直接點(diǎn)樣法和平板對(duì)峙法檢測(cè)已篩選的菌株對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌和其他5種常見真菌性病原菌的拮抗作用，結(jié)果顯示，菌株MX3-11、TJKB-24和NF2對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌的抑菌圈直徑大于0.5 cm占總數(shù)的80%；對(duì)真菌性病原菌均表現(xiàn)出不同程度的拮抗能力(表2)，這3株菌對(duì)F5黃瓜枯萎病病原菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率均大于60%，而對(duì)F9蘋果斑點(diǎn)落葉病病原菌的抑制作用較低，均小于33%。說明菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的抗菌譜較廣，具有較大的應(yīng)用潛力。

表2 抑菌率的計(jì)算

圖2 菌體及芽孢顯微攝影(100倍)

2.4 菌株的鑒定

2.4.1 菌株形態(tài)和生理生化特征 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的各項(xiàng)基本特征均表現(xiàn)出高度的一致性，菌株均為革蘭氏陽性桿菌，大小約0.87 μm ～1.18 μm×2.50 μm ～6.00 μm，好氧，周生鞭毛，產(chǎn)芽孢，菌落圓形、表面光滑、乳白色(圖2)。3株菌體的生理生化特征相同見表3。

表3 菌株生理生化特征

2.4.2 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA序列分析及菌種鑒定 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA序列長度分別為1 449 bp、1 450 bp和1 452 bp。將序列提交NCBI基因庫，獲得GenBank登陸號(hào)分別為KC495121、KC495122和KC495120。以菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA 序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Nj樹)，結(jié)果顯示這3株菌與美麗短芽孢桿菌位于同一個(gè)進(jìn)化分枝，同源性100%。因此，鑒定菌株MX3-11、TJKB-24和NF2均為美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)。[15-16]

圖3 以菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

隨著獼猴桃葉枯病的主要病原菌被確定，人們逐步開展拮抗菌種選育工作以期能夠篩選出具有生物防治作用的生物菌劑，從而達(dá)到對(duì)獼猴桃病害的田間防治目的。李娟[2-3]從獼猴桃根際土壤分離篩選出2株對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌具有拮抗作用的菌種，分別鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegatherium)，通過田間小試試驗(yàn)研究證實(shí)了菌株的抗病作用十分有效。楊靈紅[17]將對(duì)獼猴桃葉枯病具有拮抗作用的巨大芽孢桿菌進(jìn)行了He-Ne激光誘變，將菌株的拮抗能力提高了26.61%。目前，國內(nèi)主要針對(duì)獼猴桃葉枯病的生防菌劑研究僅限于這三篇報(bào)道，而國外暫未見相關(guān)報(bào)道。

筆者研究從獼猴桃根際土壤中篩選出菌株MX3-11、TJKB-24和NF2，其對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌具有明顯的拮抗作用，此外對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌、常見真菌性病原菌也具有較強(qiáng)抑菌效果，抗菌譜較廣。這3株菌能夠代謝產(chǎn)生胞外活性物質(zhì)，菌株的無菌發(fā)酵液上清對(duì)獼猴桃細(xì)菌性病原菌抑菌作用明顯，已有報(bào)道顯示短芽孢桿菌能夠產(chǎn)生廣譜且種類多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物[18]。因此，菌株MX3-11、TJKB-24和NF2具有良好的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

通過菌體形態(tài)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析將菌株MX3-11、TJKB-24和NF2均鑒定為美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)。這3株菌的篩選和鑒定極大的豐富了現(xiàn)有的對(duì)獼猴桃葉枯病具有拮抗作用的菌種研究，為開發(fā)新型拮抗生物菌劑奠定了重要基礎(chǔ)。

1995年美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)被鑒定為新種[15]，然而多年來尚未見該菌種的生防研究報(bào)道，但是近幾年國內(nèi)外研究人員正初步開展短芽孢桿菌屬的抗病促生機(jī)制研究[19-21]，這些研究成果將為探索美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)的生物拮抗機(jī)理提供重要的借鑒，從而積極促進(jìn)對(duì)該菌種的全面而深入的研究。