廣東紫珠中的苯丙素類(lèi)化合物及其抗菌活性

楊智穎，袁 歡，周 瑩，林朝展，彭光天，吳愛(ài)芝*，祝晨蔯

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006

廣東紫珠(CallicarpakwangtungensisChun.)為馬鞭草科紫珠屬(CallicarpaL.)落葉灌木，為該屬代表性藥用植物，主要分布在長(zhǎng)江以南江西、廣東、福建等地，在江西和湖南等地有廣泛栽培[1]。目前廣東紫珠已收錄于2015版《中國(guó)藥典》，藥用部位為干燥的莖枝及葉，具有收斂止血、散瘀、清熱解毒等功效，主要用于治療偏頭痛吐血跌腫痛和外傷出血。廣東紫珠是“抗宮炎片”及“抗宮炎膠囊”的主要原料藥，為民間臨床婦科及各科出血癥的常用藥物。本課題組成員近幾年來(lái)對(duì)紫珠屬植物藤紫珠(C.peii)、枇杷葉紫珠(C.kochiana)、全緣葉紫珠(C.integerrima)、裸花紫珠(C.nudiflora)和長(zhǎng)柄紫珠(C.longipes)的化學(xué)成分進(jìn)行了較為系統(tǒng)地研究[2,3]，發(fā)現(xiàn)苯丙素類(lèi)成分在該屬植物中含量尤為豐富，為該屬植物中高極性部位的主要化學(xué)成分類(lèi)型，目前文獻(xiàn)報(bào)道的有30余種。現(xiàn)代藥理研究表明，苯丙素類(lèi)化合物具有抗氧化、抗炎、抑菌、止血等多種生物活性[4]。為了豐富廣東紫珠中苯丙素類(lèi)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)型并為其后續(xù)藥理活性研究奠定豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)，本文對(duì)廣東紫珠甲醇提取物中的苯丙素類(lèi)成分進(jìn)行了分離鑒定研究，從中得到10個(gè)苯丙素類(lèi)化合物分別鑒定為3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-[4-(3-hydroxy-1-(E)-propenyl)-2,6-dimethoxyphenoxy-propyl-β-D-glucopyranoside(1)、peiioside A(2)、syringalide A 3′-α-L-rhanmnopyranoside(3)、parvifloroside A(4)、 leucosceptoside B(5)、alyssonoside(6)、longissimoside B(7)、acteoside(8)、forsythoside B(9)和poliumoside(10)。其中，化合物1為首次從馬鞭草科植物中分離得到，化合物4為首次從紫珠屬中分離得到，化合物2、5、7均為首次從該植物中分離得到。這10個(gè)苯丙素類(lèi)成分中化合物2～10結(jié)構(gòu)類(lèi)似，為苯丙烯酸類(lèi)衍生物，而化合物1區(qū)別于其他9種化合物，其結(jié)構(gòu)中含有未被苷化的苯丙烯醇結(jié)構(gòu)單元，該結(jié)構(gòu)在馬鞭草科和紫珠屬植物中的首次發(fā)現(xiàn)對(duì)從化學(xué)成分角度探討廣東紫珠在該科屬中的植物化學(xué)分類(lèi)具有指導(dǎo)意義。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)有關(guān)廣東紫珠抗菌活性研究鮮有報(bào)道，為了進(jìn)一步挖掘廣東紫珠在抗菌方面的藥理活性，本課題組在系統(tǒng)分離廣東紫珠中苯丙素類(lèi)成分的基礎(chǔ)上，選擇其中含量較為豐富的化合物6、8、9和10進(jìn)行抗菌活性研究，分別探討這4個(gè)化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制作用，以期為廣東紫珠抗菌作用機(jī)制的深入研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

2 儀器與材料

DRX 400 型核磁共振儀(德國(guó)Bruker 公司)；Triple TOF 5600質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)；制備液相(北京慧德易科技有限責(zé)任公司)；制備色譜柱(kromasil 100-5 C18柱，10 mm×250 mm，5 μm，瑞典)；AB-8 型大孔樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng))；Diaion HP 20 型大孔樹(shù)脂(日本三菱化學(xué)公司)；Sephadex LH 20(GE Healthcare)；YMC ODS-A-HG(北京慧德易科技有限責(zé)任公司)；MCI gel CHP20/P1(日本三菱化學(xué)公司)；金石蠶苷(成都普菲德生物科技有限公司，純度>98%)、連翹酯苷 B和毛蕊花糖苷(從紫珠屬植物藤紫珠中分離得到，純度>98%)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，大腸桿菌(Escherichiacoli)和綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)，均購(gòu)于上海中科康泰生物有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用廣東紫珠栽培品于2016年購(gòu)置于江西萍鄉(xiāng)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室彭光天講師鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物廣東紫珠(C.kwangtungensis)的地上部分，自然晾干，剪切粉碎后粗粉備用。原植物憑證標(biāo)本保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物研究室。

2 提取與分離

將12 kg干燥廣東紫珠枝和葉粉碎過(guò)40目篩，然后置于滲漉筒中用甲醇反復(fù)提取，提取液合并減壓濃縮后得到浸膏1 kg。然后用適量蒸餾水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，萃取液分別減壓濃縮至干，得到石油醚部位85 g，乙酸乙酯部位108 g，正丁醇部位400 g，水部位260 g。

取正丁醇萃取物(390 g)經(jīng)AB-8型大孔樹(shù)脂柱層析，依次以0%、20%、40%、70%、100%甲醇梯度洗脫，TLC檢測(cè)，合并相似流份，減壓濃縮得到5個(gè)不同梯度甲醇洗脫組分Fr.1～Fr.5。Fr.2組分分別經(jīng)MCI gel和Sephadex LH-20凝膠柱層析，以20%甲醇洗脫得到化合物2(160 mg)。Fr.3經(jīng)Diaion HP-20型大孔樹(shù)脂柱層析，分別以40%甲醇和60%甲醇洗脫得到Fr.3-1和Fr.3-2組分，F(xiàn)r.3-1組分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以20%甲醇洗脫得到化合物3(57 mg)、化合物4(53 mg)，化合物1(20 mg)；Fr.3-2組分分別經(jīng)Sephadex LH-20和RP-C18柱層析，以20%甲醇洗脫得到化合物6(359 mg)、化合物8(429 mg)、化合物9(1445 mg)、化合物10(516mg)。Fr.4經(jīng) Sephadex LH-20凝膠柱層析，以20%甲醇洗脫，后經(jīng)高壓制備液相，以乙腈:水(20∶80)洗脫，得到化合物5(25 mg) 和化合物7(50 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淺黃色無(wú)定型粉末;10%的硫酸-乙醇顯暗紫色，ESI-MS:m/z569[M+H]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ7.08(1H,d,J=2.0 Hz,H-2)，6.92 (1H,dd,J=8.2,1.8 Hz,H-6)，6.77 (2H,s,H-3′,5′)，6.75 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5)，6.55 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7′)，6.33 (1H,dt,J=15.7,5.6 Hz,H-8′)，5.14 (1H,d,J=6.6 Hz,H-7)，4.59 (1H,d,J=7.6 Hz,H-1′′)，4.29 (1H,dt,J=6.6,3.6 Hz,H-8)，4.22 (2H,dd,J=5.6,1.5 Hz,H-9′)，3.88 (6H,s,2′-OMe,6′-OMe)，3.85 (3H,s,3-OMe)，3.74 (1H,m,H-9a)，3.60 (2H,dd,J=12.1,3.7 Hz,H-9b,6′′a)，3.37(1H,m,H-5′′)，3.32 (2H,m,H-2′′,4′′)，3.20 (1H,m,H-6′′b)，3.18 (1H,m,H-3′ );13C NMR (100 MHz,CD3OD)δ131.8 (C-1)，112.6 (C-2)，148.5 (C-3)，147.2 (C-4)，115.7 (C-5)，121.3 (C-6)，82.2 (C-7)，87.0 (C-8)，62.5 (C-9)；136.0 (C-1′)，154.5 (C-2′,6′)，104.8 (C-3′,5′)，135.0 (C-4′)，131.2 (C-7′)，130.0 (C-8′)，63.6 (C-9′)；105.2 (C-1′′)，75.6 (C-2′′)，78.0 (C-3′′)，71.4 (C-4′′)，77.8 (C-5′′)，61.2 (C-6′′)，56.7 (2′,6′-OMe)，56.4 (3-OMe)；上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]基本一致,故鑒定化合物為3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-[4-(3-hydroxy-1-(E)-propenyl)-2,6-dimethoxyphenoxy]-propyl-β-D-glucopyranoside。

化合物2淺黃色無(wú)定型粉末;ESI-MS:m/z643[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ7.58 (1H,d,J=15.6 Hz,H-7′)，7.06 (1H,s,H-2)，6.95 (1H,d,J=7.0 Hz,H-5)，6.78 (1H,d,J=7.4 Hz,H-6)，6.28 (1H,d,J=15.8 Hz,H-8′)，1.06 (3H,s,Rha-CH3)，4.60 (1H,d,J=7.7 Hz,H-1′′)，5.16(1H,d,J=1.2 Hz,H-1′′′)，1.06 (3H,d,J=5.6 Hz,H-6′′′)，5.11 (1H,d,J=4.0 Hz,H-1′′′′)；13C NMR (100 MHz,CD3OD)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致,故鑒定化合物為peiioside A。

化合物3淺黃色無(wú)定型粉末;10%的硫酸-乙醇顯淺黃色，ESI-MS:m/z608[M+Li]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ7.60 (1H,d,J=15.7 Hz,H-7′)， 7.07 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6′)，6.96 (2H,d,J=6.1 Hz,H-2,6)，6.78 (2H,d,J=7.1 Hz,H-3,5)， 6.70 (1H,d,J=8.0 Hz,H-2′)，6.56 (1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-3′)， 6.29 (1H,d,J=14.8 Hz,H-8′)，5.19 (1H,d,J=1.6 Hz,H-1′′′)，4.63 (1H,d,J=6.8 Hz,H-1′′)，1.15 (3H,d,J=6 Hz,H-6′′′)；13C NMR (100 MHz,CD3OD ) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致,故鑒定化合物為syringalide A 3′-α-L-rhanmnopyranoside。

化合物4淺黃色無(wú)定型粉末;10%的硫酸-乙醇顯紫紅色，ESI-MS:m/z623[M-H]-;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ7.55 (1H,d,J=15.6 Hz,H-7′)，7.03 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′)，6.88 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6′)，6.77 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2)，6.69 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5′)，6.58 (1H,d,J=7.8Hz,H-5)，6.52 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6)，6.28 (1H,d,J=15.6 Hz,H-8′)，5.18 (1H,brs,H-1′′′)， 4.34 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1′′)， 3.92 (2H,m,H-8)，2.76 (2H,m,H-7)，1.25 (3H,d,J=5.1 Hz,H-6′′′);13C NMR (100 MHz,CD3OD) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。 上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定化合物為parvifloroside A。

化合物5淺黃色無(wú)定型粉末;10%的硫酸-乙醇顯暗紫色，ESI-MS:m/z807[M+Na]+，783[M-H ]-;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ7.66 (1H,d,J=15.8 Hz,H-7′)，7.20 (1H,brs,H-2′)，7.08 (1H,d,J=8.2 Hz,H-6′)，6.66 (1H,d,J=1.3 Hz,H-2)，6.59 (1H,d,J=8.2 Hz,H-6)，6.39 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8′)，5.19 (1H,brs,H-1′′′)，4.95(1H,d,J=0.8 Hz,H-1′′′′)，4.37 (1H,d,J=7.7 Hz,H-1′′)，3.84 (3H,s,3′-OCH3)，3.30 (3H,s,4-OCH3)，2.86 (2H,t,J=6.7 Hz,H-7)，1.09 (3H,d,J=6.0 Hz,H-6′′′)；13C NMR (100 MHz,CD3OD) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致,故將化合物鑒定為leucosceptoside B。

表1 化合物2～7的13C NMR 數(shù)據(jù)值(CD3OD)Table 1 13C NMR data of compounds 2-7 (CD3OD)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

Positiion2345676116.1121.1122.4121.3121.1736.236.436.836.336.5871.572.272.372.172.21′127.8127.2127.4127.6127.4127.62′111.0114.2114.8111.8111.6111.73′147.0147.6147.0149.4149.1149.34′148.1146.4149.3149.3150.4147.95′115.4116.7116.3116.3116.2112.86′123.5122.9123.0124.4124.2124.47′149.9144.2145.8148.8147.8147.88′127.8116.1116.1115.2114.9115.19′168.4167.7168.9168.1168.0168.0Glc-1′′98.2101.7104.1104.2103.9104.22′′77.473.383.674.675.876.23′′78.280.275.481.581.481.44′′72.270.070.170.471.870.95′′79.473.575.176.274.974.66′′65.869.964.468.568.268.4Rha-1′′′102.2102.6102.4103.0102.8103.02′′′70.571.969.872.372.272.33′′′73.971.573.772.070.272.04′′′74.877.772.073.874.273.75′′′72.471.071.970.970.770.46′′′18.618.017.618.418.318.4Api-1′′′′103.3111.1110.7111.02′′′′74.878.177.978.03′′′′80.880.680.480.64′′′′75.275.173.575.15′′′′70.668.565.465.64-OCH356.456.43′-OCH356.456.34′-OCH356.4

化合物6淺黃色無(wú)定型粉末;10%的硫酸-乙醇顯綠色，ESI-MS:m/z771[M+H]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ7.67 (1H,d,J=15.8 Hz,H-7′)，7.19 (1H,s,H-2′)，7.09 (1H,d,J=8.0 Hz,H-6′)，6.83 (1H,d,J=7.7 Hz,H-6)，6.71 (1H, s,H-2)，6.58 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5)，6.71 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5′)， 6.39 (1H,d,J=15.8 Hz,H-8′)， 5.20 (1H,s,H-1′′′)， 4.93 (1H,d,J=4.0 Hz,H-1′′′′)，4.37 (1H,d,J=7.6 Hz,H-1′′)，3.70～4.04 (1H,m,H-8)，2.79 (1H,t,H-7)，1.10 (3H,d,J=2.6 Hz,H-6′′′)；13C NMR (100 MHz,CD3OD) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致,故鑒定化合物為alyssonoside。

化合物7淺黃色無(wú)定型粉末;10%的硫酸-乙醇顯暗紫色,ESI-MS:m/z807[M+Na]+，783[M-H ]-;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ7.67 (1H,d,J=15.8 Hz,H-7′)，7.22 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2′)，7.10 (1H,d,J=8.2 Hz,H-6′)，6.84 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5′)，6.84 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5)，6.75 (1H,d,J=1.7 Hz,H-2)，6.71 (1H,dd,J=8.1,1.8 Hz,H-6)，6.38 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8′)，5.20 (1H,brs,H-1′′′′)，4.38 (1H,d,J=7.7 Hz,H-1′′)，3.90 (3H,s,4′-OCH3)，3.83 (3H,s,4-OCH3)，2.86 (2H,t,J=6.7 Hz,H-7)，1.09 (3H,d,J=6.0 Hz,H-6′′′)；13C NMR (100 MHz,CD3OD) 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致,故將化合物鑒定為longissimoside B。

化合物8、9、10均為淺黃色無(wú)定型粉末，ESI-MS:m/z623[M-H]-，m/z755[M-H]-，m/z793[M+Na]+，分別與對(duì)照品對(duì)照，依次確定化合物8為acteoside(毛蕊花糖苷)，化合物9為forsythoside B(連翹酯苷B)，化合物10為poliumoside(金石蠶苷)。

4 抑菌活性測(cè)試

選擇廣東紫珠中含量較為豐富的4種苯丙素類(lèi)化合物6、8、9和10，分別用 DMSO溶解配制成20和10 mg/mL 的溶液，DMSO作為空白對(duì)照，左氧氟沙星(50 μg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照，采用紙片擴(kuò)散法[12]，分別吸取各溶液10 μL置于經(jīng)高壓滅菌后的無(wú)菌濾紙片上，放于烘箱烘干。取生長(zhǎng)于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上的三種試驗(yàn)菌，制成菌懸液，濃度稀釋為1.0×106CFU/mL。取菌懸液各0.2 mL于培養(yǎng)基上，用涂布棒將菌液涂布均勻。用鑷子將含藥紙片貼于含有不同菌種的培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀(guān)察抑菌圈大小，每個(gè)濃度重復(fù)三次。分別測(cè)試4種苯丙素類(lèi)化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表 2。與空白組菌圈直徑6 mm對(duì)比可知，這4種苯丙素類(lèi)化合物在相應(yīng)濃度下對(duì)所試菌類(lèi)均具有不同程度的抑制作用，且抑菌效果呈量效關(guān)系。其中，化合物6的抑菌能力略?xún)?yōu)于其他3種化合物，推測(cè)該化合物中苯丙烯酸4位酚羥基的甲氧基化對(duì)抑菌活性具有增效作用。

表2 苯丙素類(lèi)化合物的抑菌活性(mm)Table 2 Antibacterial activity of four phenylpropanoid compounds (mm)

注：數(shù)據(jù)用均數(shù)±SD標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。

Note:Data are expressed as mean±SD (n=3).

5 結(jié)果與討論

從廣東紫珠地上部分醇提物中分離并鑒定得到10個(gè)苯丙素類(lèi)成分，其中化合物1為單糖苷，化合物3、4和8為二糖苷，化合物2、5、6、7、9和10為三糖苷。系統(tǒng)化學(xué)成分分離結(jié)果表明苯丙素類(lèi)成分具有良好的水溶性，主要分布在廣東紫珠中高級(jí)性部位。從化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，化合物1顯著區(qū)別于化合物2～10，其結(jié)構(gòu)中含有未被苷化的苯丙烯醇結(jié)構(gòu)單元，該化合物為馬鞭草科植物中首次發(fā)現(xiàn)，研究結(jié)果為從植物化學(xué)角度探討苯丙素類(lèi)成分在科、屬、種的分布規(guī)律和生合成途徑提供了重要的指導(dǎo)意義。在化學(xué)成分分離的基礎(chǔ)上，選擇廣東紫珠中含量較高的苯丙素類(lèi)化合物6、8、9和10進(jìn)行抑菌活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)這4種化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌均具有不同程度的抑制活性，且具有量效關(guān)系，其中化合物6的抑菌活性與其它3種化合物相比效果最佳。上述研究為廣東紫珠在抗菌活性方面的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用和臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。