甘草苷治療抑郁癥和糖尿病共病的網絡藥理學作用機制研究

劉 鵬，田俊生

1山西藥科職業(yè)學院；2山西大學中醫(yī)藥現代研究中心，太原 030006

甘草(GlycyrrhizaeRadixetRhizoma)為豆科植物甘草(GlycyrrhizuralensisFisch)，光果甘草(Glycyrrhizaglabral)或脹果甘草(GlycyrrhizainflateBat)的根莖[1]，主要活性成分是三萜皂苷、黃酮類、多糖等化合物?，F代藥理研究結果表明甘草及其主要活性成分具有抗氧化，抗腫瘤、保護神經元、抗炎、抗抑郁、降血糖[2]等多種功效。

甘草苷(liquiritin，LQ)是甘草水提物中的主要活性成分，屬于黃酮類化合物。文獻報道甘草苷具有廣泛的藥理活性，主要涉及抗衰老、抗凋亡、抗炎、防輻射、抗抑郁、神經保護、降血糖[2]等。其中，Zong等[3]從甘草抗抑郁活性成分及其在中藥復方中的應用等方面分析甘草治療抑郁癥的特點，發(fā)現其在改善動物行為學和生化指標上都有良好的療效，其機制主要涉及調節(jié)腦內單胺類神經遞質及其受體、改善下丘腦-垂體-腎上腺(HPA) 軸功能、抗自由基、抗炎等作用。Zhao等[4,5]研究甘草黃酮對2型糖尿病大鼠血糖、血脂等生化指標的影響，測定大鼠空腹血糖、血脂及肝/體、腎/體、脂/體比值，發(fā)現超氧化物歧化酶能明顯抑制2型糖尿病大鼠血糖升高和脂代謝紊亂，因此推測甘草苷具有治療糖尿病的效果。

Hopkins于2007年發(fā)表的文章中首次提到“網絡藥理學”(network pharmacology)的概念，即通過分析藥物對疾病的干預作用，構建“成分-靶點-疾病”之間的復雜網絡來探討藥物的作用機制[6]。網絡藥理學研究策略的整體性、系統(tǒng)性特點與中藥及其方劑的多成分、多途徑、多靶點協同作用的原理異曲同工。與此同時，網絡藥理學的研究方法與中醫(yī)藥理論相結合，可以推動單藥物單靶點向多組分多靶點的研究模式轉變，從整體上預測藥物靶點信息，為藥物研發(fā)提供了新的途徑和方法[7]。

“異病同治”是中醫(yī)臨床的重要治則，以“辨證論治”理論為基礎，也是中醫(yī)學區(qū)別于現代醫(yī)學的基本特征之一[8]，其科學內涵為異病-同證-同治，即不同疾病在發(fā)展過程中，表現出相同或者相似的證候，采用相同的方法來進行治療[9]。

抑郁癥合并糖尿病是臨床常見共病之一，其機制主要涉及免疫炎癥、下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸、氧化應激、BDNF、血清素(5-HT)、胰島素抵抗等[10]。抑郁與下丘腦-垂體-腎上腺素軸的活動相關，可導致升糖激素增多，胰島素分泌水平降低。高血糖氧化應激狀態(tài)下產生的過多自由基，以及與之伴隨的高分子氧化損傷可能在糖尿病誘導抑郁的發(fā)生過程中起到重要作用。同時，糖尿病引發(fā)的神經系統(tǒng)的改變，包括神經遞質的改變和神經細胞凋亡的發(fā)生等，都可能是其抑郁癥高發(fā)的原因。

目前，應用網絡藥理學方法探討異病同治科學內涵的文獻報道較少，因此，本文采用網絡藥理學的方法探究甘草苷治療抑郁癥和糖尿病的作用機制。

1 方法

1.1 甘草苷作用靶點查詢

登陸PubChem服務器(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/，2018-5-29)，輸入關鍵詞liquiritin，下載甘草苷對應的Isomeric smiles化學式以及sdf格式文件[11]。通過反向藥效團匹配PharmMapper數據庫(http://59.78.98.102/pharmmapper/get.php，2018-5-29)，上傳甘草苷的sdf格式文件，點擊Upload，按照軟件設定配體空腔要求選擇Pharmacophore Models Whose Pkd ≥ 6.0，查詢出與甘草苷有關對應根據匹配度fit score 由高到低排序前300的靶點。登陸SEA(http://sea.bkslab.org/，2018-5-29)、SIB(http://www.swisstargetprediction.ch/，2018-5-29)數據庫，輸入甘草苷的Smiles化學式，將得到的對應靶點信息與反向預測得到的靶點信息進行匯總。

1.2 抑郁癥和糖尿病靶點映射

登陸GeneCards(http://www.Genecards.org/,released in 2018-5-30) 和DrugBank(https://www.drugbank.ca/，released in 2018-04-02)數據庫輸入抑郁癥搜索已經報道的與抑郁癥或糖尿病有關的靶點，將查詢結果與甘草苷相關靶點之間進行匹配。

從STRING(https://string-db.org/，released in 2018-5-30)數據庫中分別查找抑郁癥和糖尿病各相關蛋白-蛋白之間的相互作用關系，分別上傳篩選出的甘草苷與抑郁癥，甘草苷與糖尿病相同的蛋白靶點，選擇Homo sapiens，Exports下載TSV形式數據。蛋白互作網絡(PPI)分析STRING數據庫，主要用于搜索已知蛋白質之間和預測蛋白質之間相互作用關系。其中，需要用到Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/，released in 2018-5-30)中的Uniprot 工具對蛋白名稱進行校正，選取物種為人，把所有預測出的蛋白靶點名稱中的Uniprot ID轉換成Official Gene Symbol。

Cytoscape 3.6.0是一款圖形化顯示網絡并進行分析和編輯的軟件，可用于蛋白與蛋白之間復雜的相互作用關系分析。運用網絡分析(network analyzer)工具分析中心度(betweenness centrality)和節(jié)點度(degree)兩個網絡拓撲參數[12]，計算網絡中betweenness和degree 分布等基本屬性，可對整個網絡成分-靶點-疾病性質進行評價[13]?？山柚W絡可視化手段分析圖中成分、靶點、疾病用節(jié)點(node)表示，對應關系用邊(edge)表示，邊的粗細，顏色深淺，以及節(jié)點大小，均表示兩個蛋白靶點間相互作用關系的強弱。

1.3 甘草苷治療抑郁和糖尿病共有靶點篩選

將預測出的甘草苷治療抑郁和糖尿病潛在作用靶點進行對比，即可篩選出甘草苷治療抑郁癥和糖尿病的相同潛在作用靶點，將篩選出的相同作用靶點作為研究對象再做進一步的分析。

1.4 甘草苷治療抑郁和糖尿病通路富集分析

通過在線工具DAVID(https://david.ncifcrf.gov/，2018-6-1)對甘草苷生物學過程進行GO富集分析(Gene Ontology biological process)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway)通路注釋分析[14]，生物學信息注釋數據庫，可從大量的基因或蛋白質中提取有意義的生物信息，能夠快速識別最重要的富集生物注釋[11](其中設定閾值P-value < 0.05表現為顯著富集)。

1.5 組織特異性遺傳數據篩選共有靶點

BITOLA是一種基于交互式的生物醫(yī)學發(fā)現系統(tǒng)，用于搜索與“基因或基因產物”相關的所有中間概念，在BITOLA系統(tǒng)中，中間概念目前包含醫(yī)學主題詞(MeSH)，用于指導Medline以及人類基因組織(HUGO)的人類基因。該系統(tǒng)的主要目的是通過發(fā)現生物醫(yī)學概念之間潛在的新關系為實驗者提供新線索和治療疾病的新策略[15]。臨床上，抑郁癥和糖尿病分別影響大腦和肺胃腎等組織。因此，“基因或基因產物”必須在這些組織中表達。因此使用人類EFP瀏覽器來篩選靶點是否在大腦和肺胃腎等組織中表達最強。人類EFP瀏覽器使用戶能夠直接在人體的表示上可視化大規(guī)模的人類基因表達數據集。我們首先輸入基因符號，然后選擇“絕對”的解釋方式，選擇“神經”和“骨骼免疫消化”(糖尿病涉及的臟器)的數據源。點擊“Go”后，根據相關靶點的表達水平對樣本進行著色，生成表達“分析圖”，以確定靶點在該部位是否表達最強。將治療抑郁癥和糖尿病共同的潛在作用靶點輸入BITOLA(http://bar.utoronto.ca/efp_human/cgi-bin/efpWeb.cgi)系統(tǒng)進行檢索分析。

2 結果

2.1 甘草苷作用靶點查詢

通過數據庫PharmMapper、SEA、SIB共篩選出與甘草苷相關的靶點共323個，包括PharmMapper數據庫查詢275 個，SEA中共查詢出33個人類相關蛋白靶點，SIB數據庫中共查詢出15個相關蛋白靶點，使用UniProt數據庫中的UniproKB工具進行更正后，去除與人類無關以及無對應關系或者重復的靶點后，共篩選出包括HRAS、ESR1、VEGFA、IL2在內的312個蛋白靶點。

2.2 疾病靶點的篩選

GeneCards數據庫和DrugBank 數據庫中篩選出抗抑郁的靶點與甘草苷相關的靶點進行映射，結果顯示有42個靶點為甘草苷抗抑郁的潛在作用靶點，將篩選出的作用靶點導入STRING數據庫。STRING導出數據用Cytoscape 3.6.0可視化分析的結果如圖1所示。共導入42個蛋白，有6個與其他蛋白無相互作用關系，最終的蛋白相互作用關系網絡中degree >10的排名如表1所示。

圖1 抗抑郁有關蛋白相互作用網絡圖Fig.1 Protein interaction network of depression

序號No.節(jié)點度數Degree中心度數Betweenness centrality靶點名稱Target name1170.16ESR12160.096HRAS3160.11VEGFA4130.18NOS35130.071PTGS26120.12IL27120.033NOTCH18110.016IGF1R9110.16BDNF10110.11PARP1

同理，GeneCards數據庫和 DrugBank數據庫中篩選出糖尿病的靶點與甘草苷相關的靶點進行映射，結果顯示有55個靶點為甘草苷治療糖尿病的潛在作用靶點，將篩選出的潛在作用靶點導入STRING數據庫。STRING導出數據用Cytoscape 3.6.0可視化分析的結果如圖2所示。最終degree>10的蛋白排名如表2所示。

圖2 糖尿病有關蛋白相互作用網絡圖Fig.2 Protein interaction network of diabetes

序號No.節(jié)點度數Degree中心度數Betweenness centrality靶點名稱Target name1240.32VEGFA2180.039HRAS3170.066IGF1R4160.084ESR15150.12NOS3

續(xù)表2(Continued Tab.2)

序號No.節(jié)點度數Degree中心度數Betweenness centrality靶點名稱Target name6150.017FGF27130.060IL28130.010PTGS29130.010NOTCH110110.082GSK3B11110.16DPYD

2.3 不同疾病的共同靶點篩選

采用Cytoscape3.6.0軟件構建甘草苷治療抑郁癥的潛在作用靶點與甘草苷治療糖尿病的潛在作用靶點之間相互關系網絡圖，如圖 3所示，從圖中可以看出，甘草苷治療抑郁癥和糖尿病的共同作用靶點為ESR1、HRAS、VEGFA、NOS3、PARP1、IL2、NOTCH1、IGF1R等共23個。

圖3 抑郁癥和糖尿病作用靶點網絡圖Fig.3 Network map of targets for depression and diabetes

2.4 通路富集分析

GO富集分析結果如圖4所示，其中甘草苷在糖尿病和抑郁癥治療中的潛在作用靶點GO富集分析過程包括生物過程(BP))、細胞組分 (CC)和分子功能(MF)[16]。排名靠前的過程有protein binding (17個靶點，MF)、plasma membrane (12個靶點，CC)、membrane (10個靶點，CC)、positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter(8個靶點，BP)、extracellular region (7個靶點，CC)、enzyme binding (7個靶點，MF)、singal transduction (7個靶點，BP)、positive regulation of cell proliferation (6個靶點，BP)、golgi membrane (5個靶點，CC)、positive regulation of angiogenesis(5個靶點，BP)、positive regulation of cell migration(5個靶點，BP)、oxidation-reduction process(5個靶點，BP)。在生物過程方面，RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄過程，信號轉導，細胞增殖，氧化還原的過程與抑郁癥和糖尿病的發(fā)生發(fā)展中有密切的關系。在細胞組成方面，細胞質膜，胞外區(qū)與高爾基膜可能是藥物作用與抑郁癥和糖尿病的靶點位置。在分子功能方面，與蛋白結合與酶結合是藥物與抑郁癥和糖尿病的靶點作用的方式。由此可見，甘草苷可能通過多通路，多途徑的形式治療抑郁癥和糖尿病。

KEGG代謝通路富集分析結果如圖5所示，其中導入的23個潛在作用靶點涉及的通路富集主要有PI3K-AKT(9個靶點)、癌癥信號通路(7個靶點)、Ras 信號通路(6個靶點)、Rap1信號通路(6個靶點)等，表明甘草苷相關靶點是通過調節(jié)這些通路起到治療抑郁癥和糖尿病的作用。

圖4 治療抑郁癥和糖尿病相同靶點生物學過程GO富集分析Fig.4 Analysis of GO enrichment in the biological process of the same targets in the treatment of depression and diabetes

圖5 治療抑郁癥和糖尿病相同靶點KEGG信號通路富集分析Fig.5 Analysis of KEGG pathways of the same targets in the treatment of depression and diabetes

2.5 組織特異性遺傳數據篩選共有靶點

我們使用人類EFP瀏覽器檢測了大腦和肺胃腎等組織靶點的基因表達模式[13]。PARP1和VEGFA在大腦和肺胃腎等均有表達，其中，PARP1和VEGFA兩個靶點均顯示其在大腦和肺胃腎等組織靶點的基因表達較高。

3 討論

本文通過預測分析，結果顯示23個靶點為甘草苷治療抑郁癥和糖尿病的共同作用靶點，甘草苷相關靶點通過影響PI3K-AKT、Cancer、Ras、Rap1等信號通路進一步調控抑郁癥和糖尿病的發(fā)病機理。

PPI分析選取degree>10得到的結果中，甘草苷抗抑郁潛在作用靶點中關聯度較大的蛋白有ESR1、HRAS、VEGFA、NOS3、PTGS2、IL2、PARP1。Cui J等[17]通過實驗研究分析大鼠抑郁模型中血管內皮生長因子(VEGFA)和microRNA(miRNA/miR)-27a在海馬組織和血清中的表達情況。結果表明，與正常組相比，抑郁模型大鼠海馬外周血中VEGFA mRNA蛋白表達量較低，可通過調節(jié)VEGFA含量進一步調控抑郁癥。Qu[18]通過實驗證明高糖可誘導PARP1蛋白表達量升高且高糖所致心肌細胞肥大與PARP1激活有關，而本實驗結果也證明PARP1蛋白在抑郁癥調節(jié)機制中起主要的調控作用。

甘草苷治療抑郁癥潛在作用靶點中關聯度較大的蛋白有VEGFA、HRAS、IGF1R、ESR1、NOS3、FGF2、IL2。Liu等[19]通過實驗驗證sIL-2R，IL2和T細胞轉化活性的關系，結果表明sIL-2R可阻斷IL2蛋白與T細胞結合，從而導致糖尿病。Zhang等[20]通過實驗證明成纖維細胞生長因子2(FGF2)在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。

為了進一步說明這些相同的作用靶點在治療抑郁癥和糖尿病方面的作用，本文通過DAVID分析對甘草苷治療抑郁癥和糖尿病預測出的相同靶點進行GO生物功能分析和KEGG代謝通路富集分析。GO功能分析表明，甘草苷在治療抑郁癥和糖尿病的功能方面主要體現在蛋白質結合、酶結合、血管生成正調控等方面。KEGG代謝通路富集結果表明，靶點主要涉及PI3K-AKT信號通路、癌癥信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路等方面。其中BRCA1、HRAS、KITLG、FGF1、IGF1R、IL2、NRAS、NOS3、VEGFA共9個靶點共同參與調控PI3K-AKT通路進而發(fā)揮治療抑郁癥和糖尿病的作用。Sun等[21]通過實驗研究發(fā)現，高糖可通過調節(jié)PI3K-AKT信號通路抑制血管內皮細胞的遷移、增殖和血管生成。HRAS、KITLG、FGF1、IGF1R、NRAS、PTGS2、VEGFA共7靶點共同參與調控癌癥信號通路，HRAS、KITLG、FGF1、IGF1R、NRAS、VEGFA共6個靶點參與調控Ras 信號通路，Wang等[22]通過研究表明Ras相關信號通路與抑郁癥治療、抑郁狀態(tài)神經可塑性以及抑郁癥相關神經營養(yǎng)因子均有很強的相關性，它在細胞內信號通路的調節(jié)中發(fā)揮重要的作用。HRAS、KITLG、FGF1 、IGF1R、NRAS、VEGFA 共6個靶點通過調控Rap1信號通路發(fā)揮治療抑郁癥和糖尿病的作用，其中Rap1信號通路與Ras 信號通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路均有關聯，表明Rap1在甘草治療抑郁癥和糖尿病過程中發(fā)揮重要作用。Wu等[16]的研究結果證明柴胡通過調控PI3K-AKT、MAPK、Rap1、Ras等通路發(fā)揮抗抑郁作用，與本研究結果基本相符。

BITOLA系統(tǒng)能夠直接將人類基因表達數據集可視化，從圖中可以看出PPAPR1和VEGFA在治療抑郁癥和糖尿病作用中表達較高，丘腦核、脊髓等作用部位的高表達量也為臨床上研究抑郁癥和糖尿病提供了方向。通過使用BITOLA系統(tǒng)可以制定一個新的假設:PPAPR1和VEGFA被識別為參與治療抑郁癥和糖尿病相互作用，這些結果為實驗者提供了新的線索，成為治療這兩種疾病的新策略。

BITOLA是一個基于文獻的交互式生物醫(yī)學發(fā)現支持系統(tǒng)。該系統(tǒng)的主要目的是通過發(fā)現醫(yī)學概念之間潛在的新關系，幫助研究人員做出新的發(fā)現。本文發(fā)現23個靶點為甘草苷治療抑郁癥和糖尿病的共同作用靶點，這些基因或基因產物可能在抑郁癥和糖尿病之間的通訊中起更為重要的作用。采用BITOLA中不同組織中基因或蛋白的表達，進一步發(fā)現PPAPR1和VEGFA在抑郁癥和糖尿病相關的組織中有較高的表達量。該研究為后續(xù)基因或蛋白的驗證及組織部位的選取提供了參考。

本文采用網絡藥理學方法研究甘草苷治療抑郁癥和糖尿病的作用機制，發(fā)現甘草苷可通過調控同一潛在作用靶點、相同作用機制，藥效分子作用于相同的部位發(fā)揮治療抑郁癥和糖尿病的作用，為中醫(yī)理論異病同治作用機理的深入研究提供了新的方法和思路。