抗豬瘟病毒中和性單克隆抗體的制備與鑒定

劉運(yùn)超，陳玉梅，馮麗麗，汪 磊，王聚財(cái)，陸東峰，張改平

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002；4.河南花花牛實(shí)業(yè)總公司，河南 鄭州 450006)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種接觸性、急性、高度致死性傳染病，該病在世界范圍內(nèi)流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。CSFV是一種黃病毒科CSFV屬的單股正鏈RNA囊膜病毒，基因組共編碼12種蛋白質(zhì)(Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)[2-3]。其中，C、Erns(gp44/48)、E1(gp33)、E2(gp55)蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其余8個(gè)為非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白E2分子質(zhì)量約55 ku，為糖基化的囊膜蛋白，主要位于病毒粒子表面，在病毒入侵細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4-8]；同時(shí)E2蛋白也是CSFV主要保護(hù)性抗原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗CSFV中和抗體，抵抗病毒的入侵[9-11]。采用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)制備的CSFV E2蛋白，可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗CSFV特異性抗體和中和抗體，能夠有效抑制病毒感染[12-13]。重組腺病毒載體表達(dá)的E2蛋白也能夠有效保護(hù)機(jī)體免受CSFV攻擊[14-15]；相關(guān)疫苗和免疫學(xué)研究結(jié)果顯示，高滴度抗E2蛋白抗體可有效抑制病毒感染與復(fù)制[16-18]。

前人以CSFV E2蛋白為免疫原制備了一系列的單克隆抗體，廣泛應(yīng)用于CSFV診斷方法的建立[19-20]。中性單克隆抗體能夠有效抑制病毒感染活性，在病毒與宿主的相互作用、病毒中和性抗原表位研究和免疫評(píng)價(jià)方法建立方面發(fā)揮重要作用。但是，具有中和活性的CSFV單克隆抗體報(bào)道較少，限制了CSFV的相關(guān)研究[21-24]。為此，分別以CSFV SM株和桿狀病毒表達(dá)的CSFV E2蛋白免疫BABL/c小鼠，用經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)篩選針對(duì)CSFV E2蛋白中和表位的特異性單克隆抗體，為進(jìn)一步研究CSFV中和性抗原表位和免疫評(píng)價(jià)方法建立提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 毒株、E2蛋白及細(xì)胞

CSFV SM株、牛流行性腹瀉病毒(BVDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬圓環(huán)病毒(PCV2)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌表達(dá)的CSFV E2蛋白及桿狀病毒表達(dá)CSFV E2蛋白由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、表達(dá)并純化；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒和CSFV單克隆抗體WH303購(gòu)自Proteintech公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自武漢三鷹生物公司PK15細(xì)胞、MBDK細(xì)胞、Marc145細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。PK15細(xì)胞用于CSFV和PCV2增殖、MBDK細(xì)胞用于BVDV增殖、Mac145細(xì)胞用于PRRSV病毒增殖；PRRSV單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存；骨髓瘤細(xì)胞NS0由本實(shí)驗(yàn)室保存，以含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 供試動(dòng)物

6～8 周齡SPF級(jí)BALB/c純系雌性小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 抗原制備

CSFV SM株接種PK-15細(xì)胞，擴(kuò)繁后收集病毒，經(jīng)Millipore Pellicon切向流超濾系統(tǒng)超濾濃縮后，采用Sepharose 4 Fast Flow層析柱純化獲得CSFV病毒。向純化病毒液中加入1∶2 000稀釋的β-丙內(nèi)酯，4 ℃放置72 h滅活病毒。桿狀病毒表達(dá)的CSFV E2蛋白以及原核表達(dá)的CSFV E2蛋白均帶有組氨酸標(biāo)簽，經(jīng)Ni柱親和層析純化后備用。

1.4 動(dòng)物免疫

6～8周齡的BALB/c小鼠共6只，分為A、B 2組，每組3只，其中A組小鼠免疫CSFV，B組小鼠免疫經(jīng)過(guò)純化的桿狀病毒表達(dá)E2蛋白。首次免疫每只200 μL免疫原(CSFV TCID50=106.5或25 μg E2蛋白)頸背部皮下多點(diǎn)注射，每隔21 d免疫1次，共免疫3次。首次免疫采用弗氏完全佐劑，第2、3次免疫用弗氏不完全佐劑，免疫方式與劑量同前。第3次免疫后14 d，采用間接ELISA測(cè)定免疫小鼠效價(jià)，同時(shí)采用IDEXX CSFV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫小鼠血清阻斷率，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。分別選取A、B 2組阻斷價(jià)高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫分別選用不含佐劑的CSFV和桿狀病毒表達(dá)E2蛋白抗原，按50 μg/只的劑量進(jìn)行腹腔注射。

1.5 細(xì)胞融合

加強(qiáng)免疫后3～5 d，脫頸處死小鼠，無(wú)菌取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，與生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NS0骨瘤細(xì)胞混合，按照文獻(xiàn)[19]所述方法進(jìn)行細(xì)胞融合。以HAT培養(yǎng)基對(duì)融合后細(xì)胞進(jìn)行選擇培養(yǎng)，將懸浮細(xì)胞均勻鋪至20塊96孔板，每孔300 μL，培養(yǎng)10 d后用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性孔進(jìn)行3～5輪亞克隆篩選，獲得能穩(wěn)定分泌抗CSFV E2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.6 免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)

IPMA用于檢測(cè)單克隆抗體的特異性和敏感性。將PK15細(xì)胞鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，長(zhǎng)成單層時(shí)用CSFV感染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)未感染細(xì)胞為空白對(duì)照，感染后24 h用含3% H2O2的甲醇固定液室溫固定15 min，棄去固定液，用含 5% 脫脂奶粉的PBST溶液37 ℃封閉1 h，每孔加入待檢細(xì)胞上清50 μL，同時(shí)以商品化CSFV單克隆抗體WH303為陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃孵育30 min，PBST洗6次，每孔加入50 μL(1∶1 000稀釋)的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育30 min，每孔加入50 μL的AEC顯色液5～10 min，顯微鏡下觀察，待陽(yáng)性對(duì)照孔充分顯色后，用雙蒸水終止顯色，記錄試驗(yàn)結(jié)果。用IPMA檢測(cè)抗體敏感性時(shí)，每孔加入50 μL梯度稀釋的單克隆抗體細(xì)胞上清或單克隆抗體腹水。

1.7 單克隆抗體腹水的制備及效價(jià)測(cè)定

將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集備用。取BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟(0.5 mL/只)，10 d后腹腔注射5×105～5×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。8～12 d后采集小鼠腹水，37 ℃靜置1 h，4 500 r/min離心10 min，吸取上清-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎瞄g接ELISA和IPMA檢測(cè)4株單克隆抗體腹水的效價(jià)，從1∶1 000開(kāi)始進(jìn)行2倍倍比稀釋，每孔加入50 μL倍比稀釋的單克隆抗體腹水進(jìn)行IPMA檢測(cè)。

1.8 CSFV E2 蛋白單克隆抗體的鑒定

分別選用IPMA、ELISA、Western blot鑒定單克隆抗體特異性。分別用CSFV感染PK15細(xì)胞、BVDV感染MBDK細(xì)胞、PRRSV感染Marc145細(xì)胞、PCV2感染PK15細(xì)胞進(jìn)行IPMA試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)未感染細(xì)胞作對(duì)照，具體方法參照1.6。Western blot鑒定：分別將經(jīng)桿狀病毒表達(dá)純化獲得的CSFV E2蛋白以及原核表達(dá)的CSFV E2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，一塊膠用考馬斯亮藍(lán)染色液觀察。另一塊膠用半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，PBST洗3遍，分別用雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗，室溫輕輕振蕩孵育1 h，PBST洗滌6次。以1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育30 min，PBST洗滌6次，AEC顯色，雙蒸水終止反應(yīng)，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。采用Proteintech公司生產(chǎn)的單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作，對(duì)單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定。

1.9 中和性單克隆抗體的篩選與鑒定

采用IPMA檢測(cè)單克隆抗體的中和活性，設(shè)PRRSV單克隆抗體腹水為陰性對(duì)照(NC)。將單克隆抗體腹水從1∶200開(kāi)始，進(jìn)行2倍倍比梯度稀釋，CSFV用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至200 TCID50，然后將二者等比例混合，37 ℃孵育1 h；棄去PK15細(xì)胞板中的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的病毒和單克隆抗體腹水的孵育液，37 ℃孵育培養(yǎng)2 h，棄去細(xì)胞板中液體，加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h。棄去培養(yǎng)上清，用含有3%H2O2的甲醇固定液室溫固定15 min。以1∶400稀釋的SCFV陽(yáng)性血清為一抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗6次；以1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫孵育30 min，PBST洗6次。AEC顯色后用顯微鏡觀察并記錄結(jié)果，計(jì)算抗體中和滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原純化與鑒定

采用切向流超濾濃縮法和離子交換層析法純化CSFV粒子，經(jīng)IPMA檢測(cè)，結(jié)果如圖1A所示，純化后CSFV滴度為106.5TCID50，未感染病毒的PK15細(xì)胞陰性對(duì)照組成立(圖1B)。采用Ni柱親和層析法分別純化重組桿狀病毒和重組大腸桿菌表達(dá)的CSFV E2蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析估算，其重組CSFV E2蛋白的純度均為95%左右(圖1C、1D)。

A.IPMA檢測(cè)純化的CSFV；B.IPMA陰性對(duì)照；C.SDS-PAGE檢測(cè)純化的CSFV E2(桿狀病毒來(lái)源)蛋白；D.SDS-PAGE檢測(cè)純化的CSFV E2蛋白(大腸桿菌來(lái)源)；M.蛋白質(zhì)Marker；1.桿狀病毒來(lái)源CSFV E2蛋白；2.大腸桿菌來(lái)源CSFV E2蛋白

2.2 小鼠抗體效價(jià)測(cè)定

將第3次免疫后14 d(即免疫后第56 天)的小鼠血清倍比稀釋，間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，A、B 2組抗體效價(jià)最高均能達(dá)到5.12×104；商品化抗體檢測(cè)試劑盒(IDEXX公司)檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫后56 d，6只小鼠產(chǎn)生的抗體阻斷率為72.6%～86.2%(表1)。由此可見(jiàn)，不同試驗(yàn)組的小鼠都產(chǎn)生了較高效價(jià)的抗CSFV特異性抗體，且具有一定的中和活性。

2.3 抗CSFV E2蛋白單克隆抗體的篩選

通過(guò)有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，并結(jié)合IPMA方法篩選，共篩選到4株抗CSFV E2蛋白的單克隆抗體(5D1、8H7、9A1和13B2)，IPMA結(jié)果顯示，4株單克隆抗體均能與CSFV發(fā)生特異性反應(yīng)(圖2)。

表1 ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清效價(jià)及抗體阻斷率

A.5D1；B.8H7；C.9A1；D.13B2；E.WH303；F.陰性對(duì)照

2.4 單克隆抗體腹水效價(jià)測(cè)定

間接ELISA及IPMA方法檢測(cè)4株單克隆抗體腹水的效價(jià)，結(jié)果如表2示，間接ELISA檢測(cè)4株單克隆抗體的腹水效價(jià)在2.56×105～1.02×106；IPMA效價(jià)分別為：6.40×104、1.28×105、2.56×105、1.28×105。

表2 間接ELISA及IPMA測(cè)定單克隆抗體腹水效價(jià)

2.5 單克隆抗體的特異性鑒定

采用IPMA試驗(yàn)分別檢測(cè)4株單克隆抗體與PCV2、BVDV和PRRSV的交叉反應(yīng)情況，結(jié)果顯示，4株單克隆抗體均能與CSFV發(fā)生特異性反應(yīng)，而與PCV2、BVDV和PRRSV均不發(fā)生反應(yīng)(圖3)。Western blot鑒定結(jié)果顯示，4株單克隆抗體均能與桿狀病毒表達(dá)的CSFV E2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，在約46 ku處有1條明顯的特異性反應(yīng)條帶(圖4A)；同時(shí)，也能夠與大腸桿菌表達(dá)的CSFV E2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4B)。以上結(jié)果表明，4株單克隆抗體均能特異性識(shí)別CSFV E2蛋白的線性表位。用Proteintech公司的單克隆抗體亞型鑒定試劑盒檢測(cè)4株單克隆抗體的亞型，檢測(cè)結(jié)果表明，4株單克隆抗體輕鏈都屬于κ型，其中，5D1、8H7、13B2為IgG1亞型，9A1為IgG2c亞型。

圖3 IPMA測(cè)定4株單克隆抗體的特異性

2.6 中和性單克隆抗體的篩選與鑒定

將CSFV SM株病毒液稀釋至200 TCID50，分別與4株倍比稀釋的單克隆抗體孵育，進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)。結(jié)果顯示，1∶200稀釋時(shí)，5D1、8H7、9A13株單克隆抗體有一定的中和活性，單克隆抗體13B2具有明顯的中和活性，其中和效價(jià)能達(dá)到1.28×104，而PRRSV單克隆抗體腹水的陰性對(duì)照則完全沒(méi)有中和作用(圖5)。

A.重組桿狀病毒表達(dá)的CSFV E2蛋白；B.重組大腸桿菌表達(dá)的CSFV E2蛋白；M.蛋白質(zhì)Marker；1.CSFV E2蛋白的SDS-PAGE鑒定；2.5D1；3.8H7；4.9A1；5.13B2;

圖5 4株單克隆抗體的中和抗體效價(jià)

3 結(jié)論與討論

在CSFV 結(jié)構(gòu)蛋白中，E2蛋白是主要的免疫抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的中和抗體，是制備抗CSFV單克隆抗體的理想免疫原[9-11]，CSFV E2蛋白已在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)[12-13]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì) CSFV E2 蛋白制備了一系列單克隆抗體，王愛(ài)華等[20]、許保疆等[21]分別用純化后的CSFV作為免疫原，最終獲得抗CSFV的單克隆抗體，但并未發(fā)現(xiàn)篩選到的單克隆抗體具有中和活性；夏照和等[25]以純化的桿狀病毒表達(dá)的重組HCLV-E2蛋白為耐受原、CSFV石門株E2蛋白為免疫原，采用環(huán)磷酰胺免疫抑制法制備特異性識(shí)別CSFV野毒株的單克隆抗體，獲得了1株能穩(wěn)定分泌抗E2蛋白單克隆抗體并具有中和活性的雜交瘤細(xì)胞株，但是中和效價(jià)較低。由于CSFV浮密度小，細(xì)胞培養(yǎng)病毒滴度不高，難以純化，為CSFV單克隆抗體的制備帶來(lái)了諸多難題，本研究采用經(jīng)切向流超濾系統(tǒng)超濾濃縮以獲得高滴度的CSFV，再經(jīng)過(guò)Sepharose 4 Fast Flow過(guò)濾層析純化進(jìn)而獲得純度較高的CSFV，有效解決了因粗病毒免疫小鼠后產(chǎn)生許多針對(duì)細(xì)胞成分的抗體這一難題。此外，本研究采用CSFV粒子和重組表達(dá)E2蛋白作為抗原的免疫方案，為CSFV中和性單克隆抗體的制備提供了一種新的思路。經(jīng)過(guò)阻斷ELISA測(cè)定免疫小鼠效價(jià)，分別選擇CSFV E2蛋白及純化的CSFV免疫組中阻斷效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，通過(guò)IPMA等方法篩選，獲得了4株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)鑒定，4株單克隆抗體與桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)及大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的CSFV E2蛋白均能發(fā)生特異性反應(yīng)，且與CSFV細(xì)胞毒具有良好的反應(yīng)性和高度的特異性；其中1株單克隆抗體具有較高中和活性，中和效價(jià)為1.28×104。本研究成功獲得了1株針對(duì)CSFV中和表位的特異性單克隆抗體，為進(jìn)一步研制CSFV抗原快速檢測(cè)產(chǎn)品提供技術(shù)支持，同時(shí)為CSFV中和表位鑒定以及病毒致病機(jī)制等方面的研究奠定基礎(chǔ)。