Bacillus amyloliquefaciens YM6 對鹽脅迫條件下玉米促生長作用研究

王華笑 劉環(huán) 楊國平，2，3 張琇，2，3 李壯 張炎

（1. 北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；2. 寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，銀川 750021；3. 國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)重點實驗室，銀川 750021；4. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所，烏魯木齊 830091）

土壤鹽漬化是土地退化中的最大難題，也是生態(tài)環(huán)境惡化的一種現(xiàn)象，土地鹽漬屬于土地荒漠化的一種［1］，嚴重影響著畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)的發(fā)展［2］。我國西北地區(qū)鹽漬地面積大、鹽堿化程度高，解決鹽脅迫問題，促進農(nóng)作物產(chǎn)出對西北地區(qū)農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展具有特殊意義［3］。

研究顯示，植物根際促生細菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）在降低鹽脅迫對植物影響方面發(fā)揮著重要作用［4］。PGPR 不僅能夠合成對植物生長發(fā)育有直接作用的物質(zhì)（如生長素等［5］）或提高土壤中某些元素的溶解度［6］，還可抑制或減輕某些植物病害對植物生長發(fā)育和產(chǎn)量的不良影響［7-8］。付?。?］發(fā)現(xiàn)接種菌根真菌可提高植物的耐鹽堿能力。

寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室篩選獲得一株能提高玉米耐鹽堿性能的菌株YM6，經(jīng)生理生化及16S rRNA 同源性序列比對、鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個亞種［10-12］，能夠與植物共生［13］，大量研究表明解淀粉芽孢桿菌可提高作物抗性［14］，在誘導(dǎo)植物抗病蟲和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性等發(fā)揮重要作用［15］。連彩等［16］研究表明解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生IAA 促進植物生長，但該菌在鹽脅迫條件下促進植物生長作用尚未見到報道。

本研究以鄭單958 玉米為材料，探究不同鹽濃度對玉米幼苗根長、株高、莖粗、葉綠素含量等的影響，進一步探究YM6 在鹽脅迫下對玉米的促生作用，旨在為提高玉米等非耐鹽作物產(chǎn)量開發(fā)新型菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試玉米種 鄭單958，選擇顆粒飽滿、無破損、大小一致的玉米種子作為試驗種。

供試菌株：保存于寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室、促進玉米耐鹽堿的菌株解淀粉芽孢桿菌YM6（Bacillus amyloliquefaciens），在TSA（胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基）試管培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 梯度鹽溶液的配置 用NaCl 調(diào)節(jié)鹽濃度，以Na+為鹽脅迫主要離子，根據(jù)鹽堿土分類標準［1］配制梯度鹽溶液（0、25、50、75、100、125 和150 mmol/L）。

母液2：MgSO4·7H2O 24.648 g 和去離子水500 mL；

母液3：K2HPO487.09 g、KH2PO468.443 g 和去離子水500 mL；

母液4：CaCl2·2H2O 55.495 g 和去離子水500 mL；

母液5：FeC6H5O7·3H2O 2.5 g 和去離子水500 mL；

以上5種母液各取1 mL與1 000 mL蒸餾水混合，再加入3.3 g（NH4）2SO4，即得植物營養(yǎng)液，1×105Pa 滅菌20 min 后備用。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度鹽溶液對玉米幼苗生長的影響 選取約200 粒大小一致、飽滿無損傷的玉米用95%酒精浸泡5 s 去除種子表面張力，0.1% HgCl 表面消毒40 s，無菌水沖洗4-7 次。置于鋪有濕潤無菌紗布的培養(yǎng)皿內(nèi)，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)48-72 h，萌發(fā)備用。以無鹽脅迫，即正常生長條件的玉米為對照，記為CK0；以不同濃度鹽脅迫條件下的玉米生長組為試驗組。

每個處理設(shè)置3 個重復(fù)（培養(yǎng)瓶），每個組培養(yǎng)瓶內(nèi)種植4 株玉米苗。所有處理均放置于光照培養(yǎng)箱（25℃，16 h 光照與18℃，8 h 黑暗）中培養(yǎng)，光照強度20 000 Lx。培養(yǎng)至14 d 有明顯區(qū)別后統(tǒng)計玉米的株高、根長、植株干重、植株鮮重等生長指標。

1.2.2 YM6 菌株對提高玉米幼苗耐鹽性能的影響 將催芽后的玉米幼苗種植于含有75 mmol/L NaCl 的培養(yǎng)瓶中，接種濃度為1×108CFU/mL 的YM6 菌株，接種量為20 μL/瓶，滴加于玉米幼苗根系。以無鹽脅迫、不接種試驗菌株組設(shè)為空白對照組，記為CK0；以鹽脅迫、不接種組設(shè)為脅迫對照組，記為CK1。每瓶4 株玉米苗，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，所有處理均放置于光照培養(yǎng)箱（25℃，16 h 光照與18℃，8 h 黑暗）中培養(yǎng)，光照強度20 000 Lx。培養(yǎng)至14 d 有明顯區(qū)別后，測量玉米的株高、根長、植株干重、鮮重等生長指標。

凌薇趕到美娟家的時候，美娟的尸體因為車禍被碾軋得慘不忍睹，已經(jīng)被殯儀館接走，馬上要火化。一群人正在樓下坐車，準備去殯儀館送美娟最后一程。梁誠一臉哀傷地接受著眾人的安慰，但看見凌薇后，那目光里閃過一絲恐懼。

1.2.3 鹽漬土盆栽條件下YM6 菌株對玉米植株生長的影響 取田間鹽漬土（鹽濃度為0.45%），選擇顆粒飽滿大小一致的玉米種子種植于鹽漬土中每盆3 粒種子（容器直徑6 cm，高10 cm，容積為150 mL），每組5 個平行，記為鹽脅迫組CK1，試驗組添加YM6 菌株，接種濃度為1×108CFU/mL，接種量為1 mL/盆；以無鹽育苗土（鹽濃度為0.01%）為空白對照，每隔30 d 統(tǒng)計玉米植株生長情況。

1.2.4 YM6 菌株在鹽漬土中定殖試驗 取鹽漬土（鹽濃度0.45%）分裝為3 kg/袋，25 kGy 輻照滅菌備用。試驗組將催芽后的玉米苗盆栽于鹽漬土中（容器直徑6 cm，高10 cm，容積為150 mL），滴加1 mL 濃度為1×108CFU/mL 的菌懸液于玉米根系；對照組不種植玉米苗，取與試驗組相同濃度、體積的YM6菌株接入到鹽漬土中。

計算公式為：1 g 土壤菌數(shù)（CFU/g）=平板菌數(shù)×10 mL×105

1.2.5 指標測定方法 株高、根長利用直尺測量；莖粗采用游標卡尺測量；葉綠素含量采用日立-SPAD502 葉綠素儀測量；植株干鮮重利用千分之一天平稱。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2003 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析并制圖；利用SPSS 17.0 軟件進行差異顯著性分析（Duncan 法，P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 鹽脅迫對玉米幼苗生長的影響

由表1 可見，鄭單958 玉米對低濃度鹽脅迫有一定耐受性，鹽濃度為25 mmol/L 時對玉米苗幾乎沒有影響，鹽濃度為50 mmol/L 時，根長與CK0 相比無顯著性差異。當(dāng)鹽濃度為75 和100 mmol/L 時，株高、根長、干鮮重等指標均顯著降低（P＜0.05）。鹽濃度為100 mmol/L 時，幼苗生長受抑制程度過大，不利于驗證加菌對提高玉米耐鹽性能試驗，因此，選用鹽濃度為75 mmol/L 進行后續(xù)試驗。

表1 不同鹽濃度對玉米生長指標的影響

2.2 YM6菌株對鹽脅迫條件下玉米幼苗生長的影響

從表2 可以看出，在鹽脅迫條件下隨著玉米幼苗生物量呈明顯降低趨勢，與對照組（CK0）相比，鹽脅迫組CK1 株高減少量為33.7%；根長減少量32.8%。并且加入YM6 菌株時，鹽脅迫條件下的玉米生物量呈上漲趨勢，75 mmol/L 條件下，加入YM6 菌株試驗組株高增長15.2%，根長增長22.3%，同時干鮮重表現(xiàn)均有明顯差異（P＜0.05）。

2.3 鹽漬土土培條件下YM6菌株對玉米幼苗生長的影響

從圖1 和表3 可以看出，在鹽漬土盆栽條件下，鹽脅迫對玉米生長有明顯抑制作用（P＜0.05），這種抑制作用隨著時間的延長并沒有得到緩解。當(dāng)加入YM6 菌株時，對鹽脅迫條件下玉米生長有明顯促進作用，甚至有的植株個體超過對照組CK0，最大增長量為116.7%。

表2 鹽濃度為75 mmol/L 時YM6 菌株對玉米幼苗生長影響

圖1 接種YM6 菌株后玉米幼苗的生長情況

表3 接種YM6 菌株后玉米幼苗的生長指標統(tǒng)計

2.4 鹽脅迫下YM6菌株在玉米幼苗根系定殖試驗

從圖2 可看出，種植玉米條件下YM6 菌株菌體數(shù)量明顯高于無玉米條件，試驗測得YM6 菌株定殖數(shù)在第4 天前呈增長趨勢，第4 天后菌體數(shù)量增長呈減緩趨勢，無玉米對照組菌株定殖數(shù)量在第4 天后呈緩慢下降趨勢。說明YM6 菌株在第4 天達到最大定殖數(shù)量從而穩(wěn)定發(fā)揮作用提高玉米耐鹽性。

3 討論

圖2 YM6 菌株在鹽漬土中定殖能力

鹽脅迫對植物生長抑制是一個復(fù)雜的生理生化過程，研究表明鹽脅迫下植物生長滯后，生物量降低［18］。本研究結(jié)果表明，隨著鹽濃度的增加，玉米植株生物量呈顯著降低趨勢，這與李文陽［19］對鹽脅迫不同品種玉米苗期生長的影響研究結(jié)果一致，當(dāng)鹽濃度大于75 mmol/L 時，鹽脅迫對玉米幼苗生長有顯著抑制作用，玉米葉片葉綠素含量卻呈先增加后下降趨勢，據(jù)文獻報道，低鹽條件下利于葉綠素的積累增加光合作用，鹽濃度過高時，鹽脅迫對植物葉綠體損傷不利于葉綠素合成。

YM6 菌株通過促進根系生長，增加玉米植株對營養(yǎng)元素的吸收，補充鹽脅迫對玉米植株的營養(yǎng)虧空［20］，促進玉米植株生長，進而改變玉米植株生物量。但當(dāng)鹽濃度過大接種YM6 菌株對幼苗生長恢復(fù)效果較差，可能是由于鹽脅迫對玉米幼苗損害程度大，微生物作用程度小難以恢復(fù)玉米的生長。鹽漬土盆栽試驗接種YM6 菌株可明顯促進玉米生長，并且在種植60 d 后，測定玉米植株干重較鹽脅迫不接菌組相比增加43.9%，其機理可能是微生物與玉米植株相互作用，誘導(dǎo)植株產(chǎn)生某些與耐鹽性能有關(guān)的代謝產(chǎn)物，從而降低鹽脅迫對玉米毒害作用［21］。試驗發(fā)現(xiàn)YM6 菌株能在玉米根系繁殖并保持數(shù)量穩(wěn)定，YM6 菌株利用玉米根系分泌的營養(yǎng)物質(zhì)使自身數(shù)量增加從而更好的發(fā)揮作用提高玉米耐鹽性能。但對于菌YM6 最佳條件如作用時間，以及最佳接菌量等問題還值得我們進一步探究。

4 結(jié)論

高濃度鹽脅迫明顯抑制玉米植株長勢，接種YM6 菌株可提高玉米耐鹽性，改變根系長勢，緩解鹽脅迫對玉米生長抑制，提高玉米植株干鮮重、莖粗、株高等生長指標，同時YM6 菌株可定殖于玉米根系穩(wěn)定發(fā)揮作用促進玉米生長。