免疫分子診斷急性髓系白血病患者PML/RARα融合基因重排的診斷效能評(píng)價(jià)

鄒惠安 李琳蕓 唐元艷 陳永玲 梅冰

長(zhǎng)江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（湖北荊州434020）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是臨床上常見(jiàn)的白血病類型，主要發(fā)生于成人，發(fā)病率隨著年齡的增加而升高。大多數(shù)患者表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、出血，嚴(yán)重的出血傾向可致命，因此白血病快速、準(zhǔn)確的診斷尤為重要。白血病的診斷需要結(jié)合多種檢測(cè)方法，包括形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方法［1］。免疫表型主要檢測(cè)相關(guān)免疫分子，基因重排檢測(cè)是評(píng)估患者病情和療效的重要分子生物學(xué)指標(biāo)，兩者之間存在一定關(guān)聯(lián)，如B 細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病患者CD25 是融合 基 因BCR/ABL1 標(biāo) 志 性 抗 原，CD66c、CD13、CD10 和CD38 與BCR/ABL1 相關(guān)［2-5］。目前，關(guān)于AML 患者免疫分子與融合基因表達(dá)關(guān)聯(lián)性的研究較少，本研究選取初診FAB 分型為AML 的患者，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)多個(gè)免疫分型免疫分子表達(dá)，熒光定量PCR 方法檢測(cè)融合基因PML/RARα表達(dá)，探討免疫分子與PML/RARα 融合基因之間的關(guān)系及免疫分子對(duì)PML/RARα融合基因的診斷效能，為AML 患者臨床診療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料患者來(lái)自2016年7月至2019年2月荊州市中心醫(yī)院血液內(nèi)科初診住院病例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷符合張之南等主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［6］中AML 的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）明確分型、骨髓和外周血原始細(xì)胞比例，細(xì)胞和分子遺傳學(xué)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)化型AML、治療相關(guān)AML 及其他類型非原發(fā)AML［7］。本研究共納入120 例符合要求的AML患者，男66 例，女54 例，年齡15 ～76 歲。以39 例PML/RARα陽(yáng)性患者作為研究組，其中L 型34 例，S 型2 例，V 型3 例，81 例PML/RARα陰性患者作為對(duì)照組。采集標(biāo)本時(shí)獲得患者知情同意，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫分型CD 分子表達(dá)采取骨髓標(biāo)本3 mL，EDTA 抗凝，于各檢測(cè)管中加入相應(yīng)單克隆抗體10 μL，并加入標(biāo)本75 μL，振蕩混勻，室溫避光20 min 后，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻避光10 min 后，加入1 mL PBS 洗滌，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。胞漿內(nèi)MPO 的染色首先標(biāo)記表面抗體，加入固定液100 μL，室溫避光15 min，加入3 mL PBS 洗滌離心去掉上清，加入0.1 mL溶血透膜劑5 min，加MPO 抗體室溫避光15 min，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。通過(guò)Epics-XL 型流式細(xì)胞儀CD45/SSC 設(shè)門對(duì)104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)CytExpert 軟件分析細(xì)胞的免疫分型CD分子表達(dá)。檢測(cè)的CD 分子主要有CD19 、CD10、CD5、CD20、CD2、CD4、CD3、CD8、CD7、CD15、CD14、CD13、CD33、HLA-DR、CD56、CD16、CD64、CD11b、CD117、CD34、CD38、cMPO。以表達(dá)百分比＞20%判斷為陽(yáng)性。

1.2.2 總RNA 提取及融合基因PML/RARα 檢測(cè)采集EDTA 抗凝骨髓2 ～3 mL，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 濃度和純度。PML/RARα檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廈門至善生物科技股份有限公司，以RNA 為模板檢測(cè)PML/RARα融合基因的表達(dá)，方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s 精確檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用動(dòng)差法計(jì)算峰度系數(shù)和偏度系數(shù)，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布用M（P25，P75）形式描述，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。通過(guò)受試者工作曲線（ROC）評(píng)估最佳敏感性和特異性的截止點(diǎn)［8］。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PML/RARα 陽(yáng)性組與PML/RARα 陰性組免疫分子陽(yáng)性患者率比較兩組患者均表達(dá)CD117分子，均不表達(dá)CD14、CD10、CD20、CD3 和CD8 分子。在PML/RARα 陽(yáng)性患者組中CD64 陽(yáng)性患者率較高（75.0%），在PML/RARα 陰性患者組中陽(yáng)性率較低（28.6%）；在PML/RARα 陽(yáng)性患者組中CD7、CD34、HLA-DR 陽(yáng)性患者率均較低，在PML/RARα 陰性患者組中陽(yáng)性率較高。兩組間CD64、CD7、CD34、HLA-DR 陽(yáng)性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 PML/RARα 陽(yáng)性患者組與陰性患者組免疫分子陽(yáng)性細(xì)胞率比較采用動(dòng)差法對(duì)免疫分子陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，資料不服從正態(tài)分布，組間比較用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，PML/RARα陽(yáng)性患者中CD64 陽(yáng)性細(xì)胞率四分位數(shù)均高于PML/RARα 陰性患者，CD7、CD34、HLA-DR陽(yáng)性細(xì)胞率四分位數(shù)均低于PML/RAR α 陰性患者。兩組間CD64、CD34、HLA-DR 陽(yáng)性細(xì)胞率差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 免疫分子診斷AML 患者PML/RARα融合基因重排的ROC 曲線分析CD34、HLA-DR 和CD64對(duì)判斷PML/RARα融合基因是否為陽(yáng)性有一定的準(zhǔn)確性（ROC 曲線下面積介于0.7 ～0.9）。CD34 陽(yáng)性細(xì)胞率臨界值10.7%、HLA-DR 陽(yáng)性細(xì)胞率臨界值11.1%和CD64 陽(yáng)性細(xì)胞率臨界值14.2%可用于預(yù)測(cè)和診斷AML 患者PML/RARα融合基因是否發(fā)生了重排。共陽(yáng)性CD7/CD34、CD7/HLA-DR 和CD34/HLA-DR 比單標(biāo)記物具有更高的特異度。見(jiàn)表3。

表1 PML/RARα 陽(yáng)性患者組與陰性患者組免疫分子陽(yáng)性患者率比較Tab.1 Comparison of immunomolecule positive patient rates between PML/RARα positive and negative groups

表2 PML/RARα 陽(yáng)性患者組與陰性患者組免疫分子陽(yáng)性細(xì)胞率比較Tab.2 Comparison of immunomolecule positive cell rates between PML/RARα positive and negative groups M（P25，P75）

表3 CD7、CD34、HLA-DR、CD64 對(duì)PML/RARα融合基因的診斷價(jià)值Tab.3 Diagnostic value of CD7，CD34，HLA-DR and CD64 to fusion gene PML/RARα

3 討論

AML 是一組以髓系造血干祖細(xì)胞惡性增殖為特點(diǎn)的血液系統(tǒng)惡性克隆性疾病，可發(fā)生于任何年齡，無(wú)明顯性別差異［9］。PML-RARα對(duì)AML 發(fā)病機(jī)制可以從細(xì)胞、基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的角度闡述：首先，PML-RARα的表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞周期抑制物p21 的上調(diào)，增加基因組的不穩(wěn)定性。p21 對(duì)AML 中M2、M3 起著重要的作用，在沒(méi)有p21 的情況下，APL 干/祖細(xì)胞的長(zhǎng)期生存能力明顯減弱［10］。其次，PML-RARα 能夠抑制某些miRNA 的轉(zhuǎn)錄，間接影響在白血病發(fā)生中具有重要功能的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。例如PML-RARα 可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-196a的表達(dá)進(jìn)而起到調(diào)控HOXB8 效果［11-12］。最后，PML-RARα 可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，干擾/抑制了其他轉(zhuǎn)錄因子的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子通路。研究發(fā)現(xiàn)PML-RARα 能夠與轉(zhuǎn)錄因子AP-1、GATA2、Sp1、NF-Y 和PU.1 等相互作用從而干擾了它們自身的轉(zhuǎn)錄活性和其對(duì)靶基因的調(diào)控，其中PU.1 是抑制髓系細(xì)胞發(fā)育分化至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，PML-RARα 與PU.1 相互作用，干擾其靶基因的正常轉(zhuǎn)錄，從而影響AML 細(xì)胞發(fā)展［12-15］。因此，PML-RARα對(duì)AML 部分亞型的發(fā)病和預(yù)后至關(guān)重要。

AML 常見(jiàn)高表達(dá)抗原有CD33、CD13 和MPO。但CD13、CD33 也高表達(dá)于ALL，對(duì)AML 診斷無(wú)特異性，因此不能單獨(dú)作為診斷AML 指標(biāo)［16-17］。CD34 和HLA-DR 屬于干/祖細(xì)胞的相關(guān)抗原，二者多在低分化的亞型中表達(dá)［18］；CD33+CD13+CD34-HLA-DR-被認(rèn)為是APL 特征性的免疫表型［19］，本研究符合上述研究結(jié)果：所有PML/RARα陽(yáng)性患者均有此免疫表型，其中CD33、CD13 表達(dá)陽(yáng)性率均為100%，而CD34 與HLA-DR 表達(dá)率很低。梁艷［20］、張建軍等［21］開(kāi)展了類似研究，發(fā)現(xiàn)AML 中NPM1 基因突變陽(yáng)性患者組的CD34 和HLA-DR陽(yáng)性患者率明顯低于NPM1 基因突變陰性患者組；AML-1/ETO 融合基因陽(yáng)性患者的CD34 和HLA-DR 陽(yáng)性患者率顯著高于APL 患者。目前，尚未見(jiàn)PML/RARα 融合基因的表達(dá)分析與AML 白血病細(xì)胞免疫表型的研究報(bào)道。本研究比較了PML/RARα 融合基因陽(yáng)性與陰性的AML 患者白血病細(xì)胞的免疫分子陽(yáng)性患者率，發(fā)現(xiàn)與PML/RARα融合基因陰性患者組比較，PML/RARα融合基因陽(yáng)性患者組的CD64 陽(yáng)性患者率明顯偏高，而CD7、CD34 和HLA-DR 陽(yáng)性患者率明顯偏低。

曹春等［22］研究發(fā)現(xiàn)RUNX1-RUNX1T1 陽(yáng)性患者中CD7、CD34、HLA-DR 陽(yáng)性細(xì)胞率中位數(shù)高于RUNX1-RUNX1T1 陰性患者，CD64 陽(yáng)性細(xì)胞率中位數(shù)低于RUNX1-RUNX1T1 陰性患者，但陽(yáng)性細(xì)胞率中位數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究分析PML/RARα 融合基因陽(yáng)性與陰性的AML 患者白血病細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞率，發(fā)現(xiàn)PML/RARα 陽(yáng)性患者的CD64 陽(yáng)性細(xì)胞率四分位數(shù)均高于PML/RARα陰性患者，CD7、CD34、HLA-DR 陽(yáng)性細(xì)胞率四分位數(shù)均低于PML/RARα 陰性患者。兩組間CD64、CD34、HLA-DR 陽(yáng)性細(xì)胞率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

KALINA 等［2］發(fā)現(xiàn)TEL/AML1 和MLL/AF4 陽(yáng)性患者從未出現(xiàn)CD66c 的表達(dá)，而B-ALL 的亞型“Phlike-ALL”中BCR/ABL1 與CD66c 具有相關(guān)性。其它研究發(fā)現(xiàn)CD25 是融合基因BCR/ABL1 標(biāo)志性抗原，CD13，CD10 和CD38 可能與融合基因BCR/ABL1 相關(guān)，而CD66c 和CD34 對(duì)BCR/ABL1 基因重排的預(yù)測(cè)性較差［3-5］。此外，研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用多個(gè)抗原分子時(shí)，會(huì)增加相關(guān)基因預(yù)測(cè)的特異性并降低敏感性［5］。本研究發(fā)現(xiàn)共陽(yáng)性CD7/CD34、CD7/HLA-DR 和CD34/HLA-DR 比單標(biāo)記物具有更高的特異性。CD34/HLA-DR 具有非常高的特異性和敏感性，因此CD34 和HLA-DR 聯(lián)合檢測(cè)可以作為AML 診斷的標(biāo)志，值得更深入的研究。通過(guò)ROC曲線分析CD34、HLA-DR 和CD64 對(duì)PML/RARα融合基因陽(yáng)性的臨床診斷價(jià)值，結(jié)果表明CD34、HLA-DR 和CD64 對(duì)判斷AML 患者PML/RARα是否為陽(yáng)性有一定的臨床診斷價(jià)值（P＜0.01）。因此，CD34 陽(yáng)性細(xì)胞率臨界值10.7%、HLA-DR 陽(yáng)性細(xì)胞率臨界值11.1%和CD64 陽(yáng)性細(xì)胞率臨界值14.2%可用于診斷AML 患者PML/RARα融合基因重排和表達(dá)，臨床可根據(jù)上述免疫分子表達(dá)水平對(duì)PML/RARα融合基因重排進(jìn)行預(yù)判，及時(shí)開(kāi)展融合基因的相關(guān)檢測(cè)以進(jìn)一步確診和明確病情，為患者得到及時(shí)有效的診療提供幫助?？紤]到儀器測(cè)量誤差以及樣本的局限性，這些免疫分子的診斷臨界值需要進(jìn)一步研究和確認(rèn)。

總之，本研究通過(guò)分析AML 初診患者免疫分型與PML/RARα 融合基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AML 患者中免疫分子CD34、HLA-DR 和CD64 對(duì)診斷急性髓系白血病患者PML/RARα 融合基因重排有較好的性能。