子癇前期患者血清中miR-423-5p和miR-204-5p的表達及臨床意義

尹學敬 楊占輝

河北省衡水市人民醫(yī)院1產(chǎn)科，2介入科（河北衡水053000）

子癇前期（preeclampsia，PE）是臨床上常見的一種妊娠期并發(fā)癥，在妊娠20 周后出現(xiàn)以初發(fā)高血壓及蛋白尿為主要特征的癥狀，可分為輕度PE和重度PE。PE 的發(fā)病率約為5% ～8%，是孕婦和新生兒死亡的主要原因之一［1］。PE 發(fā)病機制目前尚未明確，目前在臨床早期尚無有效的標志物或者檢測指標來預測并改善疾病預后。因此，尋找能夠預測疾病進展的檢測指標對于緩解PE 的進展改善孕婦和新生兒結(jié)局具有重要意義。MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，其包含19 ～22 個堿基，主要通過堿基互補配的原則與于靶mRNA 的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，導致靶mRNA 降解或翻譯抑制從而發(fā)揮多種生物學功能。研究［2］發(fā)現(xiàn)miRNA 的表達與腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。近年研究［3-5］表明，microRNA與PE 發(fā)生明顯相關(guān)，且miRNA 血清學檢測是一種經(jīng)濟、簡單、有效的診斷方法，可以此作為疾病診斷的生物標志物。miR-423-5p 和miR-204-5p 是發(fā)現(xiàn)較早的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNA，但是miR-423-5p和miR-204-5p 在PE 的發(fā)病中的研究較少。近來，有文獻［6-7］分別報道，miR-423-5p 在PE 早期孕婦胎盤組織和血清中表達升高，miR-204-5p 在妊高癥患者血清中［8］和在PE 患者胎盤組織中表達升高［9］。因此，筆者推測，血清中miR-423-5p 和miR-204-5p水平檢測可能與PE 的發(fā)生發(fā)展及結(jié)局有關(guān)。本研究對79 例PE 患者進行血清miR-423-5p 和miR-204-5p 水平聯(lián)合檢測，分析其與PE 發(fā)病的關(guān)系、診斷價值和預后判斷，以期為PE 臨床診斷提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年10月至2018年9月于我科定期行產(chǎn)前檢查并分娩的PE 孕婦79 例，按照第8 版《婦產(chǎn)科學》中相關(guān)標準分為輕度PE 組（40 例）和重度PE 組（39 例）。另選取同期正常孕婦100 例作為對照組。納入標準：年齡20 ～40 歲，產(chǎn)檢孕周20 ～28 周，所選孕婦均為單胎。排除標準：（1）既往有高血壓、冠心病、糖尿病、慢性腎炎和自身免疫病等；（2）嚴重的肝腎功能不全、心功能不全；（3）既往有前置胎盤、胎盤早剝、流產(chǎn)、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 觀察指標研究對象入院后記錄入院年齡、孕齡，測量血壓，均由專業(yè)婦產(chǎn)科醫(yī)師或護士完成。常規(guī)指標：抽取靜脈血檢測血常規(guī)，24 h 尿蛋白：PE 患者留取24 h 尿液，自排空膀胱后開始計時。留取尿液前先清潔外陰，將留取尿液置入清潔的容器內(nèi)，病情嚴重者留置導尿管留取標本，全部尿液混勻后送檢驗科，測定24 h 尿蛋白。儀器設備：應用日本Sysmex 型血球計數(shù)儀分析血常規(guī)；樣本血液生化指標的檢測采用日立7600-020型全自動生化分析儀；使用羅氏Cobas 8000 全自動生化分析儀測定24 h 尿蛋白水平。對患者進行追蹤、隨訪，完善患者終止妊娠時的孕周時間、血壓情況及新生兒體質(zhì)量情況等數(shù)據(jù)資料。

1.3 血清miRNA 的提取和miR-204-5p和miR-423-5p 表達水平檢測靜脈血10 mL，4 ℃1 600 ×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個新的2 mL 無酶離心管中，4 ℃16 000 ×g再次離心10 min，吸取上層血清轉(zhuǎn)移到新的2 mL 無酶離心管中，即為處理好的血清標本，于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。miRNeasy Serum/Plasma Kit（德國Qiagen公司）提取小RNA，在紫外分光光度計上測濃度，然后將濃度均調(diào)整為1 μg/μL；利 用miRNeasy Serum/Plasma Spike-In control（德國Qiagen 公司）進行標化；利用miScriptⅡReverse Transcription Kit（德國Qiagen 公司）將小RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；利用miScript SYBR Green PCR Kit（德國Qiagen 公司）進行Real time PCR，檢測血清中的miR-204-5p 和miR-423-5p 的表達水平。qPCR 反應引物序列見表1；PCR 反應條件：為預變性95 ℃15 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，70 ℃30 s，擴增40 個循環(huán)。所有樣品均做3 個平行孔，循環(huán)數(shù)取其均數(shù)。每個樣品目的基因的Ct 用加入的外參基因線蟲cel-miR-39 來標化，從而校正加入的RNA 量，ΔCt目的基因= Ct目的基因-Ctcel-miR-39，分別獲得兩組每個標本的ΔCt 值，2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平，即miR-204-5p和miR-423-5p表達水平。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用K-S 法進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布計量資料用（）表示；非正態(tài)計量資料采用M（Q1，Q3）表示，計數(shù)資料采用百分比表示。多組計量資料比較如服從正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析，若方差不齊或非正態(tài)分布用Kruskal-Wallis 檢驗和Mann-whitney 兩兩比較；變量間相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析；構(gòu)建受試者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲線評價miR-423-5p 和miR-204-5p 的診斷價值。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較各組孕婦年齡、孕齡、收縮壓、舒張壓、24 h 尿蛋白比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。輕度PE 組與重度PE 組的收縮壓、舒張壓24 h 尿蛋白明顯高于對照組（P＜0.05），且重度PE 組顯著高于輕度PE 組（P＜0.05）。輕度PE組與重度PE 組孕齡顯著高于對照組（P＜0.05）；輕度PE 組與重度PE 組新生兒體質(zhì)量顯著低于對照組，而輕度PE 組與重度PE 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 3 組間相關(guān)指標比較Tab.2 Comparison of related indicators among three groups M（Q1，Q3）

2.2 3 組血清miR-423-5p 和miR-204-5p 水平qRT-PCR 檢測miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 患者及對照組中的差異表達，結(jié)果提示與對照組比較，miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 患者中的表達明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-423-5p 和miR-204-5p 在重度PE 組表達高于輕度PE 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 患者血清中的表達Fig.1 Expression of serum miR-423-5p 和miR-204-5p in PE patients

2.3 血清miR-423-5p 和miR-204-5p 表達水平與各臨床指標與妊娠結(jié)局相關(guān)性分析Pearson 相關(guān)分析表明，miR-423-5p 表達與年齡、收縮壓、舒張壓、24 h 尿蛋白定量呈正相關(guān)關(guān)系，miR-204-5p 表達與收縮壓、舒張壓、24 h 尿蛋白定量呈正相關(guān)，miR-423-5p 和miR-204-5p 表達均與孕齡、新生兒體質(zhì)量呈負相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

2.4 診斷價值分析血清miR-423-5p 和miR-204-5p 對PE 進行聯(lián)合預測時曲線下面積為0.916。當截斷值為0.48 時，診斷價值最高，其靈敏度為78.5%，特異度是96%，且聯(lián)合診斷PE 的AUC 大于單獨診斷的AUC。見表4、圖2。

3 討論

PE 是一種妊娠期特有疾病，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且病死率較高［10］，嚴重者可導致產(chǎn)婦子癇、心肝腎等重要臟器功能會出現(xiàn)不同程度變化，心臟衰竭等各種并發(fā)癥，胎兒生長受限和腦癱，是導致孕產(chǎn)婦及新生兒死亡的主要原因之一［11］。因此尋找一種在疾病發(fā)生早期可靈敏診斷且對疾病病情及預后有評估作用的標志物成為了目前臨床研究的重點。大量數(shù)據(jù)表明，多種疾病患者外周血中miRNA 表達譜與健康對照患者不同，且其表達具有組織特異性。但是有關(guān)PE 患者循環(huán)血中miRNA 表達的報道較少。且既往報道中，多以正常孕婦血清和PE 兩組血清中miRNA 表達失衡為研究切入點，而兩種miRNA 在PE 患者血清學水平聯(lián)合檢測的價值則鮮見報道。本研究重點探討血清miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 診斷中的價值及與病情嚴重程度的關(guān)系。

表3 血清miR-423-5p 和miR-204-5p 與臨床指標及妊娠結(jié)局相關(guān)分析Tab.3 Analysis of the correlation between serum miR-423-5p and miR-204-5p and clinical indicators or pregnancy outcomes

表4 血清miR-423-5p 和miR-204-5p 對PE 診斷價值的比較Tab.4 Comparison of diagnostic value of miR-423-5p and miR-204-5p in serum for PE

圖2 血 清miR-423-5p 和miR-204-5p 預測PE 的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of serum miR-423-5p and miR-204-5p in predicting preeclampsia

miR-423-5p 在多種疾病中表達異常，如心衰患者循環(huán)miR-423-5p 表達升高，且與左室肥厚程度相關(guān)［12］。另外，許多研究［13］證實，miR-423-5p 在腫瘤組織中表達失調(diào)，參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。miR-423-5p在前列腺癌組織中表達上調(diào)，miR-423-5p 可抑制前列腺的腫瘤發(fā)展。而在骨肉瘤組織中，miR-423-5p 表達下調(diào)，抑制miR-423-5p 表達可以抑制骨肉瘤的增殖和侵襲［14］。近年研究［6-7］也發(fā)現(xiàn)，在PE孕婦胎盤組織和血清中miR-423-5p 表達異常，但在研究［7］中，miR-423-5p 的表達差異僅表現(xiàn)在疾病的早期。本研究結(jié)果顯示，PE 組miR-423-5p 表達水平高于對照組，與TIMOFEEVA 等［7］研究的結(jié)果一致。不同的是，本研究觀察了miR-423-5p 表達與臨床指標的相關(guān)性分析，進一步提示了miR-423-5p 與PE 的 相 關(guān) 性。

miR-204-5p 的抗腫瘤效應已被廣泛證實。如在黑色素瘤細胞中，miR-204-5p 模擬物可抑制腫瘤細胞侵襲［15］。miR-204-5p 可抑制肝癌細胞增殖［16］、調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移以及代謝［17］。另外，miR-204-5p 也作為血清標志物判斷前列腺癌轉(zhuǎn)移情況［18］。目前已有研究［19］以miR-204-5p 為靶點治療腫瘤，得到較好的效果。近來研究［8］發(fā)現(xiàn)，妊高癥患者血清miR-204-5p 表達升高，可作為診斷預防治療的生物標志。也有研究［9］發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p 在PE 患者胎盤組織中表達明顯增高，且能夠通過下調(diào)MMP-9 的表達使滋養(yǎng)細胞增殖和侵襲能力下降，與PE 的發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PE 組miR-204-5p 表達水平高于對照組，并進一步對miR-204-5p 表達與臨床指標的相關(guān)性進行分析，提示了miR-204-5p 與PE 的相關(guān)性。

本研究顯示，PE 組孕婦miR-423-5p 和miR-204-5p 值顯著高于對照組，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。不僅如此相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-423-5p 和miR-204-5p 與收縮壓、舒張壓、24 h 尿蛋白呈正相關(guān)，與孕齡和新生兒體質(zhì)量呈負相關(guān)。血清miR-423-5p 和miR-204-5p 對PE 進行聯(lián)合預測時曲線下面積為0.916，且聯(lián)合診斷PE 的AUC 大于單獨診斷的AUC，提示了二者聯(lián)合檢測PE 患者血清診斷的價值更高。但本研究存在標本量小的不足，結(jié)果存在一定局限性，但是對血清miR-423-5p 和miR-204-5p 用于PE 診斷、治療和預后評估具有積極的意義，因此，研究結(jié)果還需要大樣本量的數(shù)據(jù)支持，有待進一步深入研究和探討。