干擾ZEB1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與增殖、凋亡與遷移的影響

鐘軒 王紅鈺 蔣濤 馬鵬程 張超 鄭寶軍 劉金鳳

開灤總醫(yī)院 1普外科，3急診科（河北唐山063000）；2唐山市工人醫(yī)院腫瘤外科（河北唐山063000）

結(jié)直腸癌（CRC）是最常見(jiàn)的高發(fā)消化道腫瘤之一，多發(fā)于男性［1］，并且發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，目前主要采用手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療方式，雖然取得了一定的治療效果并改善了患者生存質(zhì)量，但卻未從根本上改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，特別是中晚期發(fā)生肝轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移患者的5年生存率仍未得到明顯提高［2-3］。影響患者生存率的主要原因?yàn)槟[瘤細(xì)胞過(guò)度增殖與轉(zhuǎn)移，因此抑制腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡可降低病死率［4-5］。因此，探討結(jié)直腸癌無(wú)限增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子與分子機(jī)制具有重要的理論價(jià)值與臨床意義，可進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌的惡性特征并制定更為有效的靶向治療方案。

近年來(lái)的研究表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制［6-7］，其中，轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1 在該過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用［8］。ZEB1 又稱鋅指E 盒結(jié)合蛋白1，為鋅指E 盒結(jié)合蛋白（ZEB）家族成員之一，其可能在胚胎發(fā)育及創(chuàng)傷愈合等過(guò)程中起作用［9］。隨著近年來(lái)研究的深入，檢測(cè)到ZEB1 在人體內(nèi)多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用，如在乳腺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤中ZEB1 的表達(dá)增高［10-13］。雖然目前關(guān)于ZEB1 的研究有所進(jìn)展，但是ZEB1 調(diào)控腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制尚未完全明確，有關(guān)ZEB1 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中作用的研究尚且不多。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)ZEB1 在人結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，且在結(jié)直腸癌Ⅲ+Ⅳ期（88.9%、91.7%）的表達(dá)明顯高于結(jié)直腸癌Ⅰ+Ⅱ期［14］，提示ZEB1 與結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察干擾ZEB1表達(dá)對(duì)體外結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與增殖、凋亡與遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29、LOVO、SW480 購(gòu)買于上海信裕生物工程有限公司；人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC 購(gòu)買于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑慢病毒pPLK-ZEB1-shRNA、pPLK-control-shRNA 由上海生工生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成；RPMI-1640 培養(yǎng)基（CS-0013-0026，上海莼試生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（10270106，廣州威佳科技有限公司）；McCoy′s 5A培養(yǎng)基（PM150710，武漢普諾賽生命科技有限公司）；L-15 培養(yǎng)基（L1518，Sigma）；RT-PCR 試劑（上海冠導(dǎo)生物工程有限公司）；E-cadherin、Vimentin、Twist、GAPDH 抗體（美國(guó)CST 公司）；PCR 反應(yīng)試劑盒（PR2101，北京百泰克生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要儀器熒光顯微鏡（DFM-60C，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（HBS-1096A，南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡（BLD-220，北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司）；96 孔板、6 孔板（無(wú)錫國(guó)盛生物）；流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur，美國(guó)BD）。

1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480 在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的L-15 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29 在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的McCoy′s 5A 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；人結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO 在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC 在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。4 種細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境：37 ℃、5%CO2與95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。每2 ～3 天換液1 次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合至85%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。RT-PCR 檢測(cè)4 種細(xì)胞中ZEB1 基因表達(dá)，篩選ZEB1 基因表達(dá)最高的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 干擾ZEB1 表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LOVO細(xì)胞，以2 × 105/孔的細(xì)胞密度接種于6 孔板內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，第2 天進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：干擾組轉(zhuǎn)染慢病毒pPLK-ZEB1-shRNA，干擾對(duì)照組轉(zhuǎn)染慢病毒pPLK-control-shRNA，每組3 復(fù)孔，shRNA 的終濃度為100 nmol/L，嚴(yán)格依照慢病毒感染說(shuō)明書操作。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡及RT-PCR、Western Blot 檢測(cè)檢測(cè)觀察轉(zhuǎn)染效率。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為正常對(duì)照（Control 組）。

1.2.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染48 h 后，將3 組細(xì)胞以4 × 103/孔的細(xì)胞密度接種于96 孔板內(nèi)，每組3 復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2與95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中，于培養(yǎng)的對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出培養(yǎng)板，加入5 g/L MTT 溶液20 μL，孵育4 h 后終止培養(yǎng)，加入150 μL DMSO，利用酶標(biāo)儀在490 nm 處檢測(cè)OD值。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染48 h 后，制備3 組單細(xì)胞懸液，以4 × 102/孔的細(xì)胞密度接種于6 孔板內(nèi)，每組3 復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2與95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第15 天時(shí)終止培養(yǎng)，PBS 清洗細(xì)胞3 次，甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，雙蒸水洗滌后自然干燥，顯微鏡下計(jì)數(shù)＞50 個(gè)細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染48 h 后，制備3 組單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5 × 105/mL，將200 μL細(xì)胞懸液接種于小室上層，將600 μL 含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基加入小室下層，37 ℃孵育4 h，取出小室上層，除去殘留在小室表面的細(xì)胞，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定，以結(jié)晶紫染色15 min，PBS 清洗后自然干燥，倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h 后，取3 組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4 × 105/mL 接種，消化后加入70%乙醇溶液固定1 h，PBS 清洗細(xì)胞，加入PI 進(jìn)行染色重懸，利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 RT-PCR 檢測(cè)提取各組細(xì)胞總RNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 的完整性。按照試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，5 min；95 ℃，20 s；60 ℃，1 min；共45 個(gè)循環(huán)。ZEB1 上游引物：5′- TGC ACT GAG TGT GGA AAA GC-3′，下游引物：5′- TGG TGA TGC TGA AAG AGA CG-3′。GAPDH 上游引物：5′-CGA GAT CCC TCC AAA ATC AA-3，下游引物：5′- TTC ACA CCC ATG ACG AAC AT-3′。每個(gè)樣品重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。利用2-ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 Western Blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h 后，蛋白裂解液裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白，利用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)濃度，低溫保存?zhèn)溆?。將蛋白液與Loading Buffer 充分混勻，100 ℃煮10 min，分別制作分離膠與濃縮膠，按照每孔50 μg 蛋白上樣，加入分離膠孔內(nèi)，電泳轉(zhuǎn)膜并封閉，加入一抗：ZEB1稀釋1∶1 000，1E-cadherin 稀釋1∶10 000，Vimentin稀釋1∶7 000，Twist 稀釋1∶1 000，4 ℃搖床孵育過(guò)夜；PBST 洗膜，二抗常溫孵育1 h，PBST 洗膜后ECL 顯色進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)，多組間對(duì)比采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Snk-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測(cè)ZEB1 基因表達(dá)ZEB1 基因在人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC 中呈低表達(dá)，在3 種結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，并且高侵襲性人結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO 中的ZEB1 基因表達(dá)高于低侵襲性的人結(jié)直腸癌結(jié)果細(xì)胞HT29、SW480，見(jiàn)圖1。ZEB1 蛋白Western Blot 檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR 檢測(cè)一致，見(jiàn)圖2。

2.2 轉(zhuǎn)染效率將ZEB1 基因沉默慢病毒pPLKZEB1-shRNA 載體感染人結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO，熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，可見(jiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率為（90.12 ± 4.15）%，慢病毒pPLK-control-shRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染率也在90%以上（圖3A），初步證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。RT-PCR 檢測(cè)顯示，干擾組ZEB1 基因表達(dá)明顯低于干擾對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。

2.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖于培養(yǎng)的第1、3、5、7 天檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示干擾組培養(yǎng)第3 ～7 天的細(xì)胞增殖OD值低于干擾對(duì)照組、正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干擾對(duì)照組與正常對(duì)照組的細(xì)胞增殖OD值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖1 RT-PCR 檢測(cè)不同細(xì)胞中的ZEB1 基因表達(dá)Fig.1 Detection of ZEB1 gene expression in different cells by RT-PCR（n = 3）

圖2 Western Blot 檢測(cè)不同細(xì)胞中的ZEB1 基因表達(dá)Fig.2 Western Blot detection of ZEB1 gene expression in different cells（n = 3）

2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)干擾組細(xì)胞克隆形成數(shù)目少于干擾對(duì)照組、正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干擾對(duì)照組與正常對(duì)照組細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。

2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)干擾組、干擾對(duì)照組、正常對(duì)照組遷移穿膜細(xì)胞數(shù)目分別為（31.23 ±9.13）%、（60.32 ± 12.34）%、（62.27 ± 10.55）%，干擾組遷移穿膜細(xì)胞比例少于干擾對(duì)照組、正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干擾對(duì)照組與正常對(duì)照組遷移穿膜細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖3 熒光顯微鏡與RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率（n = 3）Fig.3 Detection of transfection efficiency by fluorescence microscopy and RT-PCR

圖4 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖（n = 3）Fig.4 MTT assay for cell proliferation

圖5 克隆形成實(shí)驗(yàn)（n = 3）Fig.5 Clone formation experiment

2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)干擾組、干擾對(duì)照組、正常對(duì)照組的凋亡率分別為（18.19 ± 6.23）%、（4.27 ±1.34）%、（4.36 ± 1.88）%，干擾組細(xì)胞凋亡率多于干擾對(duì)照組、正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干擾對(duì)照組與正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

2.7 Western Blot 檢測(cè)干擾組E-cadherin 蛋白表達(dá)高于干擾對(duì)照組、正常對(duì)照組，Vimentin、Twist蛋白表達(dá)低于干擾對(duì)照組、正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干擾對(duì)照組與正常對(duì)照組E-cadherin、Vimentin、Twist 蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖8）。

3 討論

結(jié)直腸癌是發(fā)病率與病死率較高的常見(jiàn)惡性消化道腫瘤，目前的研究證據(jù)還無(wú)法明確其發(fā)病機(jī)制，因此從分子水平深入探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的可靠的靶基因具有非常重要的臨床意義。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)ZEB1 在多種腫瘤中存在基因擴(kuò)增與過(guò)度表達(dá)。呂金燕等［15］臨床研究證實(shí)ZEB1 在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且與病理組織學(xué)分類、淋巴轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)及HER-2、Ki-67 顯著相關(guān)（P＜0.05）。陳登宇等［16］的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，靶向降低BGC823 胃癌細(xì)胞ZEB1 的水平，可降低lncRNA HOTAIR 水平及細(xì)胞增殖、侵襲、遷移力。汪楠等［17］ZEB1 免疫組化表達(dá)與惡性腫瘤相關(guān)性的Meta 分析顯示，組織表達(dá)ZEB1 可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，ZEB1 的表達(dá)與腫瘤形成有一定程度的關(guān)系，對(duì)腫瘤早期診斷有一定的參考價(jià)值。

圖6 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)Fig.6 Transwell migration experiment（×100，n = 3）

圖7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)Fig.7 Apoptosis detection（n = 3）

圖8 Western Blot 檢測(cè)E-cadherin、Vimentin、Twist 蛋白表達(dá)Fig.8 Western Blot detection of E-cadherin，Vimentin and Twist protein expression（n = 3）

為了探究ZEB1 與結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系，前期研究利用免疫組織化學(xué)SP 方法檢測(cè)在結(jié)直腸癌組織、良性病變組織（腸鏡下取檢提示不典型增生或息肉）、癌旁正常黏膜組織中ZEB1 的表達(dá)，顯示ZEB1 的陽(yáng)性表達(dá)率在癌組織組（73.63%）明顯高于結(jié)直腸良性病變組（17.8%）及癌旁正常組織組（13.3%），ZEB1 的陽(yáng)性表達(dá)率在結(jié)直腸癌的Ⅲ+Ⅳ期組（88.9%）明顯高于結(jié)直腸癌Ⅰ+Ⅱ期組（58.3%），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究結(jié)果表明ZEB1 可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［14］。但有關(guān)ZEB1 在結(jié)直腸癌中的具體生物學(xué)功能還有待研究。

為進(jìn)一步探討ZEB1 與結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用沉默病毒載體感染ZEB1表達(dá)最高的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，觀察干擾ZEB1 表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡與遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾ZEB1 表達(dá)可抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞珠L(zhǎng)OVO 的增殖、克隆形成率與遷移能力，促進(jìn)其凋亡，提示ZEB1 在人結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色，為促癌基因，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

研究［18-21］已證實(shí)ZEB1 可能通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要特征即是上皮細(xì)胞極性與細(xì)胞間連接的喪失，并獲得了間質(zhì)細(xì)胞的表型，提高了遷移性與侵襲性。很多轉(zhuǎn)錄因子有具有誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，包括Snail 家族、bHLH 家族、ZEB 家族。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 及細(xì)胞角蛋白等的表達(dá)降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如Vimentin、N-cadherin、纖維粘連蛋白等的表達(dá)增加。作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化期間轉(zhuǎn)錄抑制因子之一的ZEB1，可結(jié)合到E-cadherin 的CDH1（編碼E-Cadherin）啟動(dòng)子上，最終導(dǎo)致E-cadherin 表達(dá)下調(diào)，增加上皮細(xì)胞的間質(zhì)特性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移。前期研究發(fā)現(xiàn)，E-Cadherin 在結(jié)直腸癌組中的表達(dá)明顯低于其在結(jié)直腸良性病組及正常黏膜組中的表達(dá)，且ZEB1 與E-Cadherin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r= -0.625，P＜0.01），表明E-Cadherin 表達(dá)在結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞組織的遠(yuǎn)處擴(kuò)散轉(zhuǎn)移方面有著十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾ZEB1 表達(dá)可提高上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化E-cadherin 蛋白表達(dá)，降低Vimentin、Twist 蛋白表達(dá)（P＜0.05），提示干擾ZEB1 表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移能力。

研究初步證實(shí)，干擾ZEB1 表達(dá)可抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，增加細(xì)胞凋亡，抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。但是ZEB1 可通過(guò)結(jié)合多種癌蛋白或腫瘤抑制因子來(lái)調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，其也受到microRNA 的調(diào)控，所以作用機(jī)制還需要進(jìn)一步明確。接下來(lái)將通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。