蔥蘭愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生

熊 琴，付素靜，魯萬貴

（1.銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.銅仁市萬山區(qū)魚塘侗族苗族鄉(xiāng)初級中學(xué)，貴州 銅仁 554300；3.銅仁市園林局，貴州 銅仁 554300）

蔥蘭［Zephyranthes candida（Lindl.）Herb.］，又叫蔥蓮、玉蓮、白花菖蒲蓮，為石蒜科蔥蘭屬多年生常綠草本植物，植株高20～35 cm，7—11月開花，花期較長?；ㄇo從葉叢中抽出，高出葉端，頂生一白色花，花徑2～3 cm，花瓣6，果期9—10月[1]，原產(chǎn)自南美洲。

蔥蘭株叢低矮、終年常綠、花朵繁多、花期長，是花境、花壇的鑲邊材料，也可用于林下、邊緣或半陰處，作園林地被植物[1]。目前，對蔥蘭的研究主要集中在病蟲害的防治、抗性[2-4]等方面。蔥蘭主要靠播種和分株繁殖，其種子易掉落，不易采收[1，5]，加之分株繁殖的繁殖系數(shù)低，難以規(guī)模化育苗，從而，難以滿足日益增長的園林綠化需求。組織培養(yǎng)可以快速獲得大量種苗，彌補(bǔ)常規(guī)種子繁殖和分株繁殖繁殖系數(shù)低的缺陷。此外，用種子作為外植體還可獲得無病毒的植株。蔥蘭的組織培養(yǎng)，可追溯到1992年，陳揚(yáng)春[6]用鱗片作為外植體建立了蔥蘭的無菌體系，第一次獲得了蔥蘭無菌植株。其后，鄧祖麗穎等[7]分別用葉片、鱗葉和頂芽等作為外植體，建立了高效的再生體系。本研究采用蔥蘭種子作為外植體建立無菌體系，探討其愈傷組織、叢生芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，旨在保留蔥蘭有性繁殖特征的同時(shí)，也可以快速獲得大量健康種苗，從而為蔥蘭大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)，并為蔥蘭的園林應(yīng)用提供保障。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用蔥蘭種子采于銅仁學(xué)院，經(jīng)過人工授粉后所得。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與制作 本試驗(yàn)基本培養(yǎng)基為MS，研究不同濃度的2，4-D、6-BA 和NAA 組合對蔥蘭愈傷組織及叢生芽的影響，組合設(shè)計(jì)見表1。每種培養(yǎng)基設(shè)置30 個(gè)重復(fù)處理，由于污染造成的重復(fù)數(shù)量不足的培養(yǎng)基補(bǔ)足至30 個(gè)。

表1 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)

1.2.2 外植體的消毒與接種 用流水沖洗蔥蘭種子2 h。在超凈工作臺上，首先用75%酒精對種子消毒30 s，然后用無菌水沖洗3～4 次，用無菌濾紙吸干水分，再用含氯1%～2%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，最后放入無菌水中漂洗3～4 次，把消毒好的蔥蘭種子放在無菌紙上，吸干水分后接種到培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基接種30 瓶，每瓶內(nèi)接種種子4～5 顆。繼代或叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)每支試管內(nèi)接種1 塊愈傷組織，大小為0.5 cm×0.5 cm。

1.2.3 培養(yǎng)條件與觀察 培養(yǎng)條件為溫度（25±2）℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度3 000 lx。接種后30 d 觀察培養(yǎng)基中蔥蘭的生長情況并記錄。

各培養(yǎng)基中均添加蔗糖30.0 g/L，瓊脂粉6.5 g/L，pH 值5.8 左右，培養(yǎng)基配制好后在121 ℃下滅菌20 min。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 整理，SPSS 21.0 進(jìn)行方差分析，Duncan 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率、叢生芽增殖系數(shù)的計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度激素及其組合對蔥蘭種子愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可知，不同濃度激素及其組合對蔥蘭種子愈傷組織誘導(dǎo)效果存在很大不同。在處理1 培養(yǎng)基中外植體褐化死亡，未生長出白色愈傷組織。增加2，4-D濃度后在處理2 培養(yǎng)基中只有1 瓶長出顆粒狀的白色愈傷組織，但30 d 后褐化死亡，其愈傷組織誘導(dǎo)率僅為3.3%，說明2，4-D 對愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的作用，但是單獨(dú)的2，4-D 低濃度處理對蔥蘭種子愈傷組織誘導(dǎo)作用不明顯，需與其他激素配合使用。

在復(fù)合了6-BA 的處理3 培養(yǎng)基（MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L） 中長出了白色愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)70.0%，且部分愈傷組織上分化出了莖葉，但在繼代培養(yǎng)基中愈傷組織逐漸褐化死亡。同時(shí)增加兩種激素的濃度后，在處理4培養(yǎng)基（MS+2，4-D 0.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L）上誘導(dǎo)出了白色愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)86.7%，且長出了綠色的葉子，連續(xù)繼代培養(yǎng)后，雖仍有白色愈傷組織，但一段時(shí)間后逐漸變黃、死亡。在繼續(xù)增加2，4-D 濃度、降低6-BA 濃度的處理5 培養(yǎng)基（MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L）上長出白色疏松的愈傷組織（圖1），愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)90.0%，其中部分分化出芽，長勢好，繼代培養(yǎng)3 代后，愈傷組織仍具有增殖能力。處理6 培養(yǎng)基中繼續(xù)增加2，4-D 濃度至1.0 mg/L、6-BA 濃度保持不變（MS+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L），愈傷組織的誘導(dǎo)率提高至93.3%，愈傷組織白色，部分分化出芽，長勢好，但是繼代培養(yǎng)后，白色愈傷組織增殖緩慢。處理7 培養(yǎng)基中保持6-BA 濃度不變，降低2，4-D 濃度至0.1 mg/L 時(shí)（MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L），能誘導(dǎo)出白色愈傷組織，誘導(dǎo)率為83.3%，但是愈傷組織易褐化，最終死亡。

各培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導(dǎo)率差異顯著，其中處理6 培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高，但愈傷組織繼代培養(yǎng)后增殖緩慢，綜合考慮誘導(dǎo)率及增殖效果，處理5 培養(yǎng)基（MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L）效果最好。

表2 不同濃度激素及其組合對蔥蘭種子愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果

圖1 蔥蘭愈傷組織

2.2 不同濃度激素組合對蔥蘭叢生芽誘導(dǎo)的影響

不同濃度激素組合對蔥蘭叢生芽的誘導(dǎo)結(jié)果見表3。在處理8 培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L）中的部分愈傷組織長出不定芽，不定芽為淡黃色，誘導(dǎo)率為33.3%，未分化的愈傷組織逐漸褐化；增加6-BA 濃度后，在處理9 培養(yǎng)基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L）中的愈傷組織多數(shù)能分化出芽，不定芽為淡黃色或白色，誘導(dǎo)率為66.7%，且生長狀況較好，后期叢生芽長成正常的綠色幼苗（圖2）。從叢生芽的增殖系數(shù)來看，處理9 培養(yǎng)基中平均每塊愈傷組織上誘導(dǎo)出芽的數(shù)量也比處理8 培養(yǎng)基增加94.4%。

表3 不同濃度激素組合對蔥蘭叢生芽的誘導(dǎo)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 不同濃度激素及其組合對蔥蘭愈傷組織的誘導(dǎo)

圖2 蔥蘭幼苗

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，MS+2，4-D 0.1 mg/L 和MS+2，4-D 0.2 mg/L 兩個(gè)處理對蔥蘭愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用，但效果不明顯，當(dāng)復(fù)合了6-BA 后，蔥蘭愈傷組織的誘導(dǎo)效果明顯提高，愈傷組織誘導(dǎo)率提升至70.0%以上。隨著2，4-D 濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸提高，MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L處理蔥蘭愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)90.0%，愈傷組織白色疏松，部分分化出芽，長勢好，繼代培養(yǎng)3 代后，愈傷組織仍具有增殖能力。MS+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 處理蔥蘭愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)93.3%，但其誘導(dǎo)出的愈傷組織繼代培養(yǎng)后失去分裂能力，增生很困難。綜合認(rèn)為，在不考慮激素相互作用的前提下確定2，4-D 的最佳濃度為0.4 mg/L，這與鄧祖麗穎等[7]的研究結(jié)果中2，4-D 適宜濃度1～2 mg/L 相比要低，更顯經(jīng)濟(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：2，4-D 與6-BA 復(fù)合能夠有效地誘導(dǎo)蔥蘭愈傷組織，且部分能夠分化出芽，與鄧祖麗穎等[7]研究認(rèn)為該激素組合不能由愈傷組織上分化出芽的結(jié)論不同，其原因可能與不同的激素濃度組合效果差異有關(guān)。

另外，在處理5 培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 中愈傷組織長勢最好，長出了白色的芽，且繼代培養(yǎng)中仍能保持愈傷組織增殖，這與龔雪琴等[8]在同科植物朱頂紅的愈傷組織誘導(dǎo)上的研究結(jié)果很相似，該愈傷組織是否為胚性愈傷組織并未做進(jìn)一步驗(yàn)證，但是，魯嬌嬌等[9]研究證明朱頂紅胚性愈傷組織的誘導(dǎo)需要TDZ 的參與。以上結(jié)果表明，誘導(dǎo)石蒜科植物愈傷組織可以使用激素2，4-D和6-BA 組合，并可通過調(diào)節(jié)二者的比例找到最適合的激素配方。

3.2 不同濃度激素組合對蔥蘭叢生芽的誘導(dǎo)

本研究選用了6-BA 與NAA 的激素組合對蔥蘭愈傷組織進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)，增加6-BA 濃度能夠提高叢生芽的誘導(dǎo)率，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L 處理叢生芽誘導(dǎo)率為66.7%，叢生芽的增殖系數(shù)為3.5，這與鄧祖麗穎等[7]對同種激素組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，與劉鐸等[10]對朱頂紅的研究結(jié)果相近。

3.3 蔥蘭種子愈傷組織、叢生芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基

本研究認(rèn)為，蔥蘭種子愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L，叢生芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。通過組織培養(yǎng)的方法，可以滿足大規(guī)模園林綠化的需求，也豐富了生物技術(shù)在園林綠化植物上的應(yīng)用。

4 展望與不足

用蔥蘭的種子作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織和叢生芽取得了一定的進(jìn)展，對蔥蘭大規(guī)模的生產(chǎn)具有一定的參考作用，但外植體的來源還不豐富，對叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)還需進(jìn)一步優(yōu)化，對不定根的誘導(dǎo)及幼苗的移栽都有待進(jìn)一步研究。