高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜法檢測全蝎酶解液中蛋白類成分 (>10 kDa)的實驗研究

張政 孫志藝 王涵琪 王集會 史磊

摘 ?????要：建立了用高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜法來檢測全蝎酶解液中蛋白類成分（>10 kDa） 的分析方法。采用未涂層彈性熔融石英毛細(xì)管柱（93 cm×0.75 μm），有效柱長為79 cm;二極管陣列檢測器;50 mbar壓力進(jìn)樣10 s;運行電壓為-30 kV;柱溫為20 ℃;運行時間為60 min;考察不同檢測波長、緩沖溶液種類、pH、濃度等對色譜峰的影響，并對10批樣品做了相似度評價。在緩沖溶液濃度為0.2 mol·L-1、pH=5.0硼酸緩沖溶液時響應(yīng)值較高，譜圖效果最好;檢測波長為220 nm時出峰較多、吸收好，初步建立了以25個峰為共有峰的指紋圖譜。結(jié)論：25個峰的高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜共有模式可以作為全蝎酶解液中蛋白類成分（>10 kDa）的鑒別方法。

關(guān) ?鍵 ?詞：高效毛細(xì)管電泳;蛋白;全蝎酶解液

中圖分類號：R 284.2 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）06-1144-05

Abstract： A method of protein detection of scorpion enzymolysis solution （>10 kDa） by HPCE was established. Elastic-uncoated-fused silica capillary column （93 cm×0.75 μm） with 79 cm effective column length was used as well as diode array detector， the sampling time at 50 mbar was 10 s， the operating voltage was 30 kV， the column temperature was 20 ℃， the operation time was 60 min.The effect of detection wavelength， buffer solution type， pH and concentration on chromatograms was investigated， meanwhile the similarity evaluation of 10 batches of samples was carried out. The results showed that， when 0.2 mol·L-1 borate with pH=5.0 was used as the buffer solution， the response value was higher， and the spectrum was the best. When the detection wavelength was 220 nm， the peak kinds was multiple and the UV absorbance was stronger， and the fingerprint spectrum of 25 peaks was established preliminarily. At last， it's pointed out that common model of HPCE chromatographic fingerprints of the 25 peaks can be used to detect the proteins of scorpion enzymolysis solution （>10 kDa）.

Key words： High performance capillary electrophoresis; Protein; Enzymolysis liquid of scorpion

動物藥是我國傳統(tǒng)中藥中的重要組成部分，具有資源廣、活性強、療效獨特的特點。經(jīng)過長時間的研究發(fā)現(xiàn)，全蝎酶解液中的粗提混合物在體內(nèi)對荷瘤小鼠（Lewise肺癌）的抑制率稍弱于西藥對照藥順鉑，而其超濾物蛋白類成分體內(nèi)抗荷Lewise肺腺癌小鼠的活性強于順鉑常用量的療效[1，2]，這一結(jié)果充分地證明全蝎酶解物凍干粉蛋白類成分具有較強的抗肺腺癌的活性，而且主要物質(zhì)基礎(chǔ)是蛋白多肽類物質(zhì)，提純物具有更高的藥理活性，很有必要對其進(jìn)行成份研究。

目前，中藥成分分析的方法有很多，包括：高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和高效毛細(xì)管電泳（HPCE）等色譜法[3]。其中，HPLC法最為常用，但用HPLC法進(jìn)行中藥成分分析有難以避免的缺點，像如分析時間長、分辯率低、色譜柱容易被污染，會嚴(yán)重影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[4，5]。

毛細(xì)管電泳（CE），亦稱高效毛細(xì)管電泳（HPCE），是近十幾年來迅速發(fā)展起來的一種分析方法。以是高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和（或）分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的一種液相分配技術(shù)[6]。與傳統(tǒng)的電泳技術(shù)和現(xiàn)代色譜技術(shù)相比，有以下幾個特點：微量、高效、分析速度快、分析對象廣、多模式、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。毛細(xì)管電泳具有多種分離模式，有多種功能，應(yīng)用十分廣泛，通常能配制成溶液或懸浮溶液的樣品均能用CE進(jìn)行分離和分析[7，8]。毛細(xì)管電泳的柱效與分子擴(kuò)散系數(shù)成反比[9，10]，對于擴(kuò)散系數(shù)小、分子量較大的蛋白多肽類物質(zhì)的分析就有很大的優(yōu)勢，對中藥資源的研究起到了無可替代的推動作用。為了更加精確的研究全蝎酶解液中抗腫瘤的蛋白類成分，特用高效毛細(xì)管電泳法來檢測。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

Agilent 3DEC高效毛細(xì)管電泳儀，配有二極管陣列檢測器;93 cm（有效柱長為79 cm）×0.75 μm未涂層彈性熔融石英毛細(xì)管柱。

1.2 ?試劑

全蝎酶解液凍干粉樣品（分子量>10 kDa）由山東中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)實驗室自制，硼砂，硼酸，磷酸，磷酸二氫鉀，0.1 mol·L-1氫氧化鈉。實驗用試劑均為分析純，實驗用水均為純凈水。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?供試品的制備

精密稱取全蝎酶解液凍干粉（相對分子量>10 kDa）0.4 g，加6 mL純凈水溶解，于10 mL容量瓶中，加純凈水定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品[11]。

2.2 ?電泳條件

未涂層彈性熔融石英毛細(xì)管柱（93 cm×0.75 μm）， 有效柱長為79 cm;二極管陣列檢測器;50 mbar壓力進(jìn)樣10 s[2]; 運行電壓為-30 kV;柱溫20 ℃[3];供試品用相應(yīng)的緩沖溶液稀釋一倍。毛細(xì)管使用前依次用0.1 mol·L-1氫氧化鈉、純凈水沖洗毛細(xì)管 5 min， 再用緩沖液沖洗至基線平穩(wěn)后開始進(jìn)樣，每兩次進(jìn)樣之間設(shè)定緩沖液沖洗 5 min[12-14]。上述試劑使用前均用0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.3 ?單因素考察

2.3.1 ?檢測波長確定[4]

按照本實驗2.2中的固定電泳條件，在0.2 mol·L-1的硼酸緩沖溶液;pH 5.0條件下，分別在波長220、245、280 nm進(jìn)行測定，記錄并分析不同波長條件下的色譜圖，見圖1。

結(jié)果顯示，在檢測波長為220 nm時吸收峰較多，強度適宜。故選將檢測波長設(shè)為220 nm。

2.3.2 ?緩沖溶液種類的確定

按照本實驗2.2中的固定電泳條件，在檢測波長為220 nm;pH=5.0條件下，分別選用硼砂緩沖溶液[4]、硼酸緩沖溶液[15]、磷酸緩沖溶液[16]進(jìn)樣分析，觀察色譜峰情況，見圖2。

由圖2可知，緩沖溶液為硼砂緩沖溶液時，色譜峰很少，強度很低;為磷酸緩沖溶液時，不出峰;為硼酸緩沖溶液時，色譜峰數(shù)目比前幾種緩沖液要多，峰強度適宜。因此分析選擇硼酸緩沖溶液比較好。

2.3.3 ?緩沖溶液濃度的確定

按照本實驗2.2中的固定電泳條件，在檢測波長220 nm;pH=5.0條件下，在選定硼酸緩沖溶液后，考察了不同緩沖液濃度（0.1、0.2、0.3 mol·L-1）對分離度的影響，見圖3。

由圖3可知，隨著緩沖溶液濃度增加，色譜峰強度減弱，分析時間延長。綜合譜圖分析，選擇0.2 mol·L-1硼酸緩沖溶液色譜峰形最好。

Fig.3 A （0.1 mol·L-1 boric acid buffer solution）， B （0.2 mol·L-1 boric acid buffer solution）， C （0.3 mol·L-1 boric acid buffer solution）

2.3.4 ?緩沖溶液pH的確定[4]

按照本實驗2.2中的固定電泳條件，在0.2 mol·L-1的硼酸緩沖溶液;檢測波長220 nm條件下，本實驗考察了pH=5.5、5.0、4.5不同pH時的分離狀況，見圖4。

由圖4可知，pH=5.5，出峰數(shù)目最少;pH=4.5次之;pH=5.0時最好。綜合譜圖分析，選擇pH=5.0時色譜峰峰形，分離效果最好。

2.4 ?方法學(xué)考察[10，11，17]

2.4.1 ?穩(wěn)定性實驗

一份供試品配置后0、2、6、10、24 h按照本實驗所選的最優(yōu)實驗條件進(jìn)樣分析，選擇10號峰為參比峰，結(jié)果樣品在24 h內(nèi)，共有峰的相對遷移時間RSD<2.021%，相對峰面積RSD<3.001%，表明供試品在測定的24 h穩(wěn)定。

2.4.2 ?精密度實驗

取同一試樣，按照本實驗所選擇的最優(yōu)實驗條件進(jìn)樣分析6次，選擇10號峰為參比峰，計算共有峰的相對遷移時間RSD<2.217%，相對峰面積RSD<4.980%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 ?重現(xiàn)性實驗

取6份全蝎酶解凍干粉，按照本實驗所選的最優(yōu)實驗條件進(jìn)樣分析，選擇10號峰為參比峰，計算各峰的相對遷移時間、相對峰面積，計算RSD，計算出各峰的相對遷移時間RSD<2.972%，相對峰面積RSD<4.641%，證明本實驗方法重現(xiàn)性好。

2.5 ?指紋圖譜的建立[18，19]

根據(jù)十批次樣品測定結(jié)果給出的峰數(shù)、峰面積和峰位（相對遷移時間）等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的比較，確定優(yōu)化的指紋圖譜，見圖5。

2.6 ?指紋圖譜分析

2.6.1 ?共有指紋圖譜的標(biāo)定

2.6.2 ?相似度評價

取十批次已溶解的供試品于樣品管中，按照本實驗所選擇的最優(yōu)實驗條件進(jìn)樣分析。比較十批次供試品的色譜圖，應(yīng)用EXCEL表格，對十批次進(jìn)樣數(shù)據(jù)分析，形成對照譜圖，見圖6。

經(jīng)共有模式譜圖計算相似度。見表1。

表1表明，本實驗10批次進(jìn)樣得到譜圖的相似度都在0.999左右，證明本實驗10批次進(jìn)樣得到的譜圖相似度好。

3 ?討 論

本實驗重點研究了緩沖溶液對于分離的影響。本實驗研究表明，采用在2.2中固有的實驗條件下，采用檢測波長220 nm;0.2 mol·L-1的硼酸緩沖溶液;pH=5.0時對全蝎酶解液蛋白類成分檢測效果好，由本實驗獲得的高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜可以作為全蝎酶解液蛋白類成分（相對分子量>10 kDa）定性或定量的依據(jù)。

毛細(xì)管電泳技術(shù)的研究與應(yīng)用，為藥物分析、藥物研究等領(lǐng)域帶來了生機(jī)與活力，尤其是在中成藥復(fù)方制劑的分析研究、中藥材種屬的鑒定和基因工程藥物研究方面的進(jìn)展迅速[3，4]，令人矚目。

但毛細(xì)管電泳法也有難以完全改善的缺點。例如，毛細(xì)管柱內(nèi)徑很小，蛋白質(zhì)易于吸附堵塞，另外雖然通過改變緩沖溶液可以減少蛋白質(zhì)的吸附，但由于毛細(xì)管電泳分離模式的多樣性，蛋白質(zhì)吸附問題仍是亟待解決的問題之一。再有與HPLC相比，高效毛細(xì)管電泳存在重現(xiàn)性差的問題，雖然選擇了比較優(yōu)的實驗條件，但實驗結(jié)果對于蛋白質(zhì)的定量分析遠(yuǎn)不如高效液相色譜法簡便、重現(xiàn)性高。由于蛋白的相對分子質(zhì)量大，不同蛋白的等電點也不相同，pH值改變，相對應(yīng)的蛋白的電泳方向可能也會發(fā)生改變，所以高效毛細(xì)管電泳法在目前來說并不是最優(yōu)的蛋白定量方法。

雖然如此，毛細(xì)管電泳技術(shù)在中藥復(fù)方制劑研究中仍發(fā)揮著重要的作用，隨著科技的不斷發(fā)展，相信毛細(xì)管電泳技術(shù)應(yīng)用將會更加廣泛。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉穎，朱曉明，王彥多，曹廣超，施東方，呂迎蘭，王集會，史磊.正交實驗優(yōu)化美洲大蠊粉混合酶酶解工藝[J].當(dāng)代化工， 2018， 47 （06）： 1131-1134.

[2]馮成強，張文生，崔光紅，黃璐琦. 半夏及其混淆品水半夏的蛋白高效毛細(xì)管電泳法鑒別[A]. 中國中醫(yī)科學(xué)院.中醫(yī)藥發(fā)展與人類健康——慶祝中國中醫(yī)研究院成立50周年論文集（下冊）[C].中國中醫(yī)科學(xué)院：，2005：2.

[3]劉婷，姜金斗，劉寧. 毛細(xì)管電泳檢測奶粉中添加的大豆分離蛋白[J]. 分析科學(xué)學(xué)報，2008（01）：37-41.

[4]石燕. 荷斯坦牛乳蛋白毛細(xì)管電泳指紋圖譜的建立及應(yīng)用[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[5]陶然. 中藥刺五加和麻黃的毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究[D].重慶大學(xué)，2006.

[6]李樂，陳志濤，夏之寧，楊豐慶，張新娜. 毛細(xì)管電泳法在測定蛋白質(zhì)或多肽的理化特性中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)通報，2014（01）：12-18.

[7]杜旭. 高效毛細(xì)管電泳在中醫(yī)藥領(lǐng)域的最新進(jìn)展和應(yīng)用研究[J]. 天津藥學(xué)，2011（05）：33-37.

[8]霍玉榮. 超高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 首都食品與醫(yī)藥，2016（10）：25-26.

[9]孔毅，吳如金，吳梧桐. 高效毛細(xì)管電泳及其在蛋白質(zhì)、多肽分析中的應(yīng)用[J]. 藥學(xué)進(jìn)展，2000（04）：204-208.

[10]賈萍. 指紋圖譜與中藥質(zhì)量控制[J]. 中國藥業(yè)，2004（02）：79-80.

[11]陳志良，陳振德，侯連兵，許重遠(yuǎn)，劉建武，楊西曉. 枸杞子蛋白多肽的高效毛細(xì)管電泳法鑒別[J]. 中國藥學(xué)雜志，2001（03）：48-50.

[12] 孫毓慶，孫國祥，金郁. 毛細(xì)管電泳指紋圖譜及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用在中藥質(zhì)量控制中的作用[J]. 色譜，2008（02）：160-165.

[13]王賢純，范春明，唐新科，陳平，梁宋平. 牛血清白蛋白胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析及其三種數(shù)據(jù)庫搜尋鑒定方法的比較[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2004（03）：393-398.

[14]陳振德，許重遠(yuǎn)，莊志銓，侯連兵. 穿山甲及其炮制品蛋白多肽高效毛細(xì)管電泳法鑒定[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報，2000（04）：302-304.

[15]徐毅勵，陳媛梅，鄭彩霞. 高效毛細(xì)管電泳法研究重瓣榆葉梅花中蛋白質(zhì)的動態(tài)變化[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016（05）：76-82.

[16]汪勇，高培峰，趙新穎，屈鋒. 毛細(xì)管電泳法表征多肽及糖蛋白的穩(wěn)定性[J]. 色譜，2013（06）：543-549.

[17] 侯連兵，陳振德，陳志良，許重遠(yuǎn)，楊西曉. 三七及其混淆品蛋白多肽高效毛細(xì)管電泳法鑒別[J]. 中草藥，2000（11）：61-62.

[18] 李敏，武曉林，張影，趙權(quán).高效毛細(xì)管電泳法同時測定樺褐孔菌中7種核苷類成分的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志，2017（02）：152-156.

[19]曾艷萍，劉訓(xùn)紅，李俊松. 沙苑子的HPCE指紋圖譜鑒別[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐，2007（04）：18-20.