正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選香加皮中總黃酮的提取工藝

唐春偉 梁宗義 田志龍 鄒婧 王舒玉 王彥予 王俊香

摘 ?????要：通過正交實(shí)驗(yàn)法，優(yōu)選香加皮藥材中總黃酮的最佳提取工藝。以香加皮中總黃酮的提取率作為指標(biāo)，采用超聲輔助法對(duì)香加皮藥材中總黃酮進(jìn)行提取，以乙醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、溫度（C）三個(gè)提取條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)。對(duì)香加皮中總黃酮提取影響最大的因素是溫度，超聲輔助法提取香加皮總黃酮的最佳條件為：乙醇濃度90%，溫度60 ℃， 超聲時(shí)間為35 min，藥渣重復(fù)提取一次。在此工藝條件下香加皮中總黃酮的提取率為2.313%。用超聲輔助法進(jìn)行香加皮總黃酮提取操作簡便、提取率高，此數(shù)據(jù)結(jié)果可為香加皮的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

關(guān) ?鍵 ?詞：香加皮;總黃酮;單因素實(shí)驗(yàn);正交實(shí)驗(yàn);超聲輔助法提取

中圖分類號(hào)：R284.2 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）06-1166-04

Abstract： The optimal extraction process of total flavonoids from cortex periplocae was preferred by orthogonal experiment. The extraction ratio of total flavonoids from cortex periplocae was considered as index， the flavonoids were extracted by ultrasonic assisted method. Single factor experiment with ethanol concentration（A）， ultrasonic time（B） and temperature（C） as three conditions was carried out. Based on the single factor experiment， the orthogonal experiment of three factors and three levels was designed. The results showed that the most important factor affecting the extraction of total flavonoids from cortex periplocae was the temperature. The optimal conditions for the extraction of total flavonoids from cortex periplocae by ultrasonic assisted method were as follows： the ethanol concentration 90%， the temperature 60 ℃，the ultrasonic time 35 min. The dregs were extracted again. Under above condition， the extraction rate of total flavonoids from cortex periplocae was 2.313%. Ultrasound-assisted extraction of total flavonoids from cortex periplocae is simple and efficient. The results of this data can provide theoretical basis for the further study of cortex periplocae.

Key words： Cortex periplocae; Total flavonoids; Single factor experiment;Orthogonal test; Ultrasonic assisted extraction

香加皮為蘿摩科植物杠柳Periploca sepium Bge.的干燥根皮。又名狹葉蘿藦、羊奶條、臭槐、羊角槐，羊交葉等。春、秋二季采挖，剝?nèi)「?，曬干藥用。最早記載于古籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中，自1977年起《中國藥典》均有收載[1]，香加皮具有利尿消腫、祛風(fēng)濕、止痛抗炎的功效，主治風(fēng)濕痹痛、水腫、小便不利，對(duì)于心悸氣短、慢性心力衰竭等也有較好的效果[2]，此外香加皮還具有抗腫瘤的作用[3]，但由于香加皮毒性較大，不易多用、久用。香加皮中的強(qiáng)心苷、江柳毒苷、多糖等成分被較為廣泛的研究，但對(duì)于香加皮中總黃酮成分的研究則較少。

黃酮類物質(zhì)廣泛存在于自然界中，生理、藥理活性強(qiáng)，不良反應(yīng)較少[4]，是已證實(shí)具有抗炎、抗氧化、止咳、平喘與抗癌等多種生物功能活性的多元酚物質(zhì)[5-7]，其中香加皮中的抗炎作用來源于黃酮類化合物。

本實(shí)驗(yàn)在于用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選香加皮中總黃酮的最佳提取工藝，為中藥香加皮總黃酮化合物的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?實(shí)驗(yàn)儀器

UV9100B紫外可見分光光度計(jì) （北京萊伯泰科儀器有限公司）;FA-1204B電子天平 （上海天美天平儀器有限公司）;XMT數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱 （上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;KQ-500GVDV型雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）; ST 16R高速冷凍離心機(jī) （賽默飛世爾科技 （中國） 有限公司）。

1.2 ?試藥與試劑

中藥香加皮（產(chǎn)地：山西運(yùn)城 批號(hào)：180918 生產(chǎn)企業(yè)：亳州市永剛飲片廠有限公司）;蘆丁對(duì)照品 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;無水乙醇為分析純，氫氧化鈉、亞硝酸鈉、六水氯化鋁試劑也均采用分析純。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用電子天平精密稱取蘆丁對(duì)照品20.00 mg，將稱取的對(duì)照品放入干燥的燒杯中，再加入60%乙醇溶液充分溶解，等待充分溶解后轉(zhuǎn)入容量瓶中，定容至100 mL，充分靜置后得到濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取上述濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL置于20 mL具塞試管中，然后補(bǔ)加30 %的乙醇溶液至試管5 mL（上述試管依次加入5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.00 mL），稍后再加入0.30 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，等待充分混合均勻后放置6 min， 然后加入0.60 mL 10 %的六水氯化鋁溶液，等待充分混合均勻后再放置5 min，然后加入2.00 mL 4%的NaOH溶液， 最后加入30 %乙醇溶液定容至試管10 mL，等待充分混合均勻后再放置15 min。15 min過后利用紫外分光光度計(jì)在510 nm波長處分別測(cè)定上述溶液吸光度[8]。

2.2 ?供試品試劑的配制

將干燥的中藥香加皮粉碎成粗粉，用電子天平精密稱取至2.000 g，加入錐形瓶中， 按照固定料液比1：20（g：mL）加入乙醇溶液， 用超聲輔助法提取兩次，以5 000 r·min-1離心10 min，抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中， 最后用乙醇溶液定容。

2.3 ?供試品吸光度的測(cè)定

吸取1.0 mL供試品試劑于25 mL具塞試管中，補(bǔ)加4 mL 30%乙醇溶液至試管5 mL，然后加0.30 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，等待充分混合均勻后放置6 min，然后加0.60 mL 10 %的六水氯化鋁溶液，等待搖勻后放置5 min，然后加2.0 mL 4%的NaOH溶液， 最后加30%的乙醇溶液定容至試管10 mL， 等待充分搖勻后放置15 min。用紫外分光光度計(jì)在510 nm波長處測(cè)定吸光度。

2.4 ?香加皮中總黃酮提取率計(jì)算

黃酮提取率 = （A×0.697 4+0.002）×100/2 000

式中： A—吸光度值。

2.5 ?單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 ?提取溫度對(duì)香加皮中總黃酮提取率的影響

按照固定料液比1：20、70%乙醇溶液、超聲時(shí)間25 min的條件下，提取兩次，研究提取溫度對(duì)香加皮中總黃酮化合物得率的影響。提取溫度分別為30、40、50、60、70 ℃。

2.5.2 ?超聲時(shí)間對(duì)香加皮中總黃酮提取率的影響

按照固定料液比1：20、70%乙醇溶液、提取溫度60 ℃，提取兩次的條件下，研究超聲時(shí)間對(duì)香加皮中總黃酮化合物得率的影響。超聲時(shí)間考察5、15、25、35、45 min。

2.5.3 ?乙醇濃度對(duì)香加皮中總黃酮提取率的影響

按照固定料液比1：20、提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間25 min的條件下，提取兩次，研究乙醇濃度對(duì)香加皮中總黃酮化合物得率的影響。乙醇濃度考察70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇。

2.6 ?正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別按提取溫度50、60、70 ℃，提取時(shí)間15、25、35 min，乙醇濃度70%、80%、90%這三個(gè)因素中的三個(gè)水平選擇L9 （34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，見表1。采用Spass軟件進(jìn)行方差分析。

3 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 ?黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線及曲線方程

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度分別作為橫、縱坐標(biāo)，得到y(tǒng) =1.470 6x + 0.000 3的回歸方程，其中R2=0.999 2，擬合度良好，說明蘆丁濃度與吸光度有較好的線性關(guān)系，見圖1。

3.2 ?單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 ?溫度對(duì)香加皮中總黃酮化合物提取率的影響

對(duì)超聲清洗器溫度的考察結(jié)果見圖2。由圖2知，提取溫度在30～60 ℃時(shí)，隨著溫度升高香加皮中總黃酮提取率上升，這是由于溫度升高能夠增強(qiáng)溶劑滲透，分子擴(kuò)散速度加快， 黃酮的溶出量也會(huì)隨之增加， 提取溫度大于60 ℃時(shí)，隨著溫度升高香加皮中總黃酮提取率下降，這是由于過高溫度可能導(dǎo)致黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被氧化破壞，部分蛋白凝固不利于黃酮溶出，因此其提取含量降低[9，10]。因此用超聲輔助法提取香加皮總黃酮的最佳溫度條件為60 ℃，取50、60、70 ℃進(jìn)行三水平正交試驗(yàn)。

由圖3可知，提取時(shí)間在5～25 min時(shí)，隨超聲時(shí)間增長，香加皮中總黃酮提取率升高，當(dāng)超聲時(shí)間超過25 min時(shí)，黃銅溶出量下降，這說明超聲間過長反而影響黃酮溶出量。因此提取香加皮中總黃酮最佳超聲時(shí)間為25 min。取超聲時(shí)間15、25、35 min進(jìn)行三水平正交試驗(yàn)。

3.2.3 ?乙醇濃度對(duì)香加皮中總黃酮的影響

對(duì)乙醇濃度的考察結(jié)果見圖4。

由圖4可知，乙醇濃度在60%～90%時(shí)，隨醇濃度升高，香加皮中總黃酮提取率升高，這可能是由于乙醇濃度較低，有效成分黃酮沒能夠充分溶出，隨醇濃度的不斷升高，香加皮中總黃酮化合物的提取率增加，這是因?yàn)辄S酮類化合物中含有親脂性基團(tuán)，苯環(huán)與甲基等，隨著乙醇濃度提高黃酮類化合物更有利于溶出。當(dāng)醇濃度高于90%時(shí)，黃酮類化合物提取率下降，乙醇濃度過高會(huì)導(dǎo)致溶劑的極性相應(yīng)下降， 進(jìn)而一些黃酮苷化合物的溶解度下降， 干擾黃酮的提取，另外由于香加皮中含有其它醇溶性雜質(zhì)，隨醇濃度升高，雜質(zhì)溶出增多，黃酮類化合物溶出量下降[11-13]。由此可以看出利用超聲輔助法提取香加皮中總黃酮乙醇濃度最佳條件為90%。取乙醇濃度70%、80%、90%進(jìn)行三水平正交試驗(yàn)。

3.3 ?正交試驗(yàn)結(jié)果

通過三因素水平表設(shè)計(jì)L9 （34） 正交試驗(yàn)來優(yōu)選超聲輔助法提取香加皮中總黃酮的最佳工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表3方差分析可以看出， B的P值為0.036，C的P值為0.000，兩者P值均比0.05小，在范圍之內(nèi)，說明B和C因素為本實(shí)驗(yàn)主要影響因素，而A因素的P值為0.071大于0.05，說明A因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。即溫度與超聲時(shí)間是超聲輔助法提取香加皮中總黃酮的主要影響因素，乙醇濃度對(duì)超聲輔助法提取香加皮中總黃酮影響較弱。超聲輔助法提取香加皮中總黃酮的最優(yōu)組合為A1（A2）B3C2，也就是最佳工藝條件為醇濃度70%（或80%）、超聲時(shí)間35 min、溫度60 ℃。

3.4 ?最優(yōu)工藝條件的驗(yàn)證

用電子天平精密稱取中藥香加皮粉末2.000 g三份，在最佳工藝條件下（醇濃度80%、提取時(shí)間35 min、溫度60 ℃）進(jìn)行提取，按“1.3.3”下的方法進(jìn)行吸光度的測(cè)定，并根據(jù)“1.3.4”下的方法進(jìn)行香加皮中總黃酮提取率的計(jì)算，結(jié)果見表4。

4 ?討 論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)以及最優(yōu)工藝條件的驗(yàn)證，最終得出超聲輔助法提取香加皮中總黃酮化合物的最佳工藝條件為溫度60 ℃、醇濃度80%、超聲時(shí)間35 min，也得出最佳工藝條件下香加皮中總黃酮化合物的提取率為2.313%。由于傳統(tǒng)工藝提取黃酮不僅繁瑣復(fù)雜，并且有提取率低的缺陷，高效的超聲輔助法使用越來越廣泛[14]。超聲輔助法提取香加皮中總黃酮具有操作簡便，提取時(shí)間短，無污染，成本較低等優(yōu)點(diǎn)[15]，重復(fù)性與精密度良好更加說明實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定可行。

黃酮類化合物 （flavonoids compounds），是一類廣泛存在于自然界中，由植物光合作用產(chǎn)生的具有2-苯基色原酮 （flavone） 結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，因其藥用價(jià)值很高，具有廣泛的藥理活性，因而對(duì)黃酮類化合物的研究較為廣泛，目前為止，被鑒定出來的黃酮類化合物已經(jīng)有8 000多種[16]。中藥香加皮中含有較多天然藥用成分，如多種甙類物質(zhì)和一些醇類物質(zhì)等，藥用價(jià)值較高。目前已有多種主要藥效成分來自于香加皮的中藥新藥上市，對(duì)于中藥香加皮的研究與開發(fā)十分火熱[17]，可對(duì)中藥香加皮總黃酮化合物的抗炎以及抗腫瘤作用做藥理活性研究，其臨床應(yīng)用價(jià)值與新藥開發(fā)前景光明。本實(shí)驗(yàn)中香加皮總黃酮提取率為2.313%，產(chǎn)率較高，可為香加皮中總黃酮的進(jìn)一步考察研究做鋪墊，在工業(yè)生產(chǎn)中也有較好的應(yīng)用前景。

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