野生與養(yǎng)殖全蝎水提液中化學(xué)成分含量及抗病毒作用的對比研究

張瑞 毛會秀 桑曉 劉金虎 張欣欣 王集會 史磊 張珊珊

摘 ?????要：為了觀察比較野生與養(yǎng)殖全蝎凍干粉水提液中主要成分含量及其抗病毒作用，分別采用改良 Lowry法測定蛋白質(zhì)含量， 阿利新藍法測定糖胺聚糖含量，重量法測定醇提物含量， MTT法考察兩種全蝎水提成分對HSV、RSV、EV71病毒的抑制作用。結(jié)果蛋白質(zhì)含量、糖胺聚糖含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。兩者對病毒的抑制效果比較中，養(yǎng)殖全蝎水提液效果優(yōu)于野生全蝎。經(jīng)過兩者間幾個主要成分含量的比較以及抗病毒抑制作用的比較，野生與養(yǎng)殖全蝎原粉水提液中主要化學(xué)成分含量變化不大，但養(yǎng)殖全蝎抗病毒作用優(yōu)于野生全蝎。

關(guān) ?鍵 ?詞：全蝎;凍干粉;蛋白質(zhì);糖胺聚糖;醇提物;抗病毒

中圖分類號：R978.7 ??????文獻標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）06-1158-04

Abstract： To observe and compare the content of main components and its antiviral effect of water extracts of wild and cultivated scorpion freeze-dried powder， the protein content was determined by modified Lowry method，the glycosaminoglycan content was determined by Alcian blue method and the content of extract of alcohol was determined by refluxing method; MTT assay was used to investigate the inhibitory effects of two water extracts on HSV， RSV and EV71 viruses. The experimental data showed that there was no statistically significant difference in protein content and glycosaminoglycan content. In the comparison of inhibitory effect of two viruses， the effect of cultured whole scorpion water extract was better than that of wild whole scorpion water extract. After comparing the content of several main components and the antiviral inhibition between the two water extracts， the content of main chemical components in wild and cultured scorpion water extracts did not change much， but the anti-viral effect of cultured scorpion was better than that of wild scorpion.

Key words： Scorpion; ?Freeze-dried powder; ?Protein; ?glycosaminoglycan; ?Alcohol extract; ?Antiviral property

全蝎為鉗蝎科動物東亞鉗蝎Buthus martensii Karsch的干燥體，是我國傳統(tǒng)的中藥材，主要產(chǎn)于山東、河南、河北等地，全蝎中含有蝎毒素類蛋白、酸性黏多糖等，辛、平，有毒[1]，有研究表明全蝎具有抗病毒的作用。但是全蝎藥材的質(zhì)量容易受多方面因素的影響，比如生長環(huán)境的改變、生長周期的延長、全蝎性別的不同、采收時間的不確定以及使用不完全相同的加工方法，這些條件的改變都會使全蝎的質(zhì)量不均一，在臨床上的效果也會有所改變。目前，由于野生全蝎資源越來越少，因此出現(xiàn)了大量的人工養(yǎng)殖全蝎，養(yǎng)殖全蝎和野生全蝎同樣作為中藥材使用，但其功效是否能完全代替野生全蝎未有充分研究，在之前的實驗中我們用HPLC柱前衍生化測定野生與養(yǎng)殖全蝎中游離?；撬岬暮縖2]、野生與養(yǎng)殖全蝎酶解液體外抗Hep-2、A549腫瘤細(xì)胞株的實驗[3]，結(jié)果表明養(yǎng)殖全蝎中的?；撬岷扛?、抗腫瘤活性更強。因此通過對比野生與養(yǎng)殖全蝎水提液中化學(xué)成分含量和抗病毒作用，以期進一步了解兩者的差別，為用養(yǎng)殖全蝎全面替代野生全蝎在生產(chǎn)和臨床中的使用提供實驗基礎(chǔ)。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

雙人單面生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;Memment-CO2培養(yǎng)箱（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）; Mettler AE240 電子天平（瑞士梅特勒公司出品）;UV9100B可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）; LC-10AT VP（日本島津公司出品）;ST16R高速冷凍離心機（默飛世爾科技（中國）有限公司）;TS-100型Nikon倒置顯微鏡（Japan）;EL340i 型全自動酶標(biāo)儀（MoLecuLar Devices）;MSM-2008型超濾器（上海摩速科學(xué)器材）。

1.2 ?試劑

牛血清白蛋白（上海伯奧生物科技有限公司）;噻唑藍（MTT）（齊魯制藥有限公司，批號：MFCD00011964）;阿利新藍（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10102335）;利巴韋林（齊魯制藥有限公司）;硫酸軟骨素（北京索萊寶科技有限公司，批號：20150914）; 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（賽默飛世爾生物制品北京有限公司）;其他試劑均為分析純。

1.3 ?藥材

養(yǎng)殖全蝎;野生全蝎;兩種全蝎都從山東臨沂采購，經(jīng)高德民教授鑒定為東亞鉗蝎。分別從野生全蝎和家養(yǎng)全蝎中挑選出成年蝎，洗凈，在 -80 ℃ 凍干，粉碎，勻漿，冷凍干燥成粉，兩者做同法處理。

1.4 ?細(xì)胞

猴胚胎腎細(xì)胞（MA104），細(xì)胞株由山東省立醫(yī)院提供。

1.5 ?病毒

單純皰疹病毒（HSV），呼吸道和胞病毒（RSV），手足口病毒（EV71），均由山東省立醫(yī)院提供。

2 ?方法

2.1 ?全蝎水提液的制備[4]

分別取等質(zhì)量的野生與養(yǎng)殖全蝎粉，加30倍體積水超聲10 min，靜置后再重復(fù)上述步驟2 次。提取液以3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得全蝎水溶性提取物溶液。

2.2 ?蛋白質(zhì)含量測定[5]

2.2.1 ?制備供試品溶液

分別精密移取兩種全蝎粉水提液各1.00 mL，將其加入10 mL容量瓶中，用量筒加入定量的蒸餾水至容量瓶刻度線10 mL，靜置片刻，用力震蕩將兩種水提液混合均勻，將其置于冰箱中用于接下來的含量測定。

2.2.2 ?制備對照品溶液

精密稱取20.000 0 mg牛血清白蛋白，用蒸餾水定容至100 mL的容量瓶中，得到200 ?g·mL-1 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置10 min，將其震蕩使牛血清白蛋白充分溶解，放冰箱中用于接下來的含量測定。

2.2.3 ?制備標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]

準(zhǔn)備6支相同的10 mL試管，分別精密量取牛血清白蛋白溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，將其分別加于試管中，加蒸餾水至1.00 mL，加2.00 mL堿性銅，震蕩使其混合均勻，室溫下放置大約10 min，然后快速精準(zhǔn)加入0.20 mL酚試劑，在室溫下靜置30 min，在可見分光光度計620 nm處測定對照品牛血清白蛋白溶液的吸光度。橫坐標(biāo)為牛血清白蛋白溶液的濃度，縱坐標(biāo)為測定的吸光度，根據(jù)橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，C為牛血清白蛋白溶液的濃度，A為測定的吸光度。

2.2.4 ?樣品含量的測定

精密移取2.2.1下各供試品溶液以及空白溶液對照品1.00 mL置于10 mL刻度試管中，加堿性銅溶液2.00 mL，搖勻，室溫放置10 min，快速加入酚試劑0.20 mL，室溫放置30 min，于620 nm處測定野生全蝎和家養(yǎng)全蝎的吸光度。根據(jù)2.2.3得到的回歸方程分別求得野生全蝎和家養(yǎng)全蝎中蛋白的含量，并通過分析得出是否具有顯著性差異。

2.3 ?糖胺聚糖含量的測定[7]

2.3.1 ?配制阿利新藍溶液

精密稱取15.00 mL的H3PO4溶液和2.00 mL的 H2SO4溶液，然后在兩種溶液中加入100 mL的蒸餾水，充分震蕩將其混合均勻，得到混合溶液。將pH調(diào)為1，將0.11 g的阿利新藍中加入到量取出來的適量混合溶液中，即配制成阿利新藍染色液，置冰箱中用于糖胺聚糖的測定。

2.3.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取0.10 g的硫酸軟骨素對照品置100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，分別量取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL的對照品溶液，將6個容量瓶中分別加入15 mL 2.3.1配好的阿利新藍溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其靜置10 min，在 可見分光光度計490 nm處測定對照品的吸光度。設(shè)置橫坐標(biāo)為對照品溶液的濃度，縱坐標(biāo)為測定的吸光度，根據(jù)橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到C為對照品濃度，A為吸光度的回歸方程。A=1.057 2C+0.0201（r=0.999 3）。

2.3.3 樣品含量的測定

根據(jù)“2.3.2”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，精密量取野生全蝎和家養(yǎng)全蝎水提液各1 mL，測定樣品中糖胺聚糖的含量，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中糖胺聚糖含量。

2.4 ?醇提物測定[8]

稱定供試品約2～4 g（精密稱定），置250 mL錐形瓶中，精密加50% 的乙醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h， 連接回流冷凝管，加熱沸騰，保持微沸1 h，冷卻至室溫，取錐形瓶密塞稱質(zhì)量，用水補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液22 mL，置于干燥后的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，干燥器中冷卻30 min，迅速精密測定質(zhì)量。

2.5 ?抗病毒作用測定[9]

2.5.1 ?MA104細(xì)胞的培養(yǎng)

將凍存的MA104細(xì)胞從超低溫冰箱中取出，迅速放到已經(jīng)加溫至37 ℃的蒸餾水中，等到凍存液溶化后，轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中，用離心機在1 000 r/min離心三分鐘，吸去凍存液，將管底的細(xì)胞用10%胎牛血清的1640將細(xì)胞吹散均勻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。

2.5.2 ?藥物對細(xì)胞毒性的測定

將生長對數(shù)期的MA104細(xì)胞消化，以1×105的密度接種于96孔板中，在37 ℃ 5% CO2孵育過夜，待細(xì)胞長至90%后，吸去培養(yǎng)基，將兩種全蝎水提液分別二倍稀釋九個濃度，接種至細(xì)胞中，設(shè)4個復(fù)孔，設(shè)置細(xì)胞對照及陽性對照，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 ?L MTT，在培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 ?L DMSO，預(yù)留出4個空白對照孔，用酶標(biāo)儀在492 nm處測定OD值，計算野生全蝎和家養(yǎng)全蝎對細(xì)胞的最大無毒濃度，以便接下來的體外抗病毒實驗。

細(xì)胞抑制率=[1-（給藥組平均OD值-校準(zhǔn)組平均OD值）/（細(xì)胞對照組平均OD值-校準(zhǔn)組平均OD值）]×100%

2.5.3 ?體外抗病毒測定

將兩種全蝎水提液從最大無毒濃度起用含2%胎牛血清的1640培養(yǎng)基維持液從最大無毒濃度起依次二倍稀釋，每孔50 ?L接種于MA104已長至90%的96孔板中，然后每孔加入50 ?L 100倍TCID50濃度的病毒液，設(shè)置細(xì)胞對照，病毒對照，利巴韋林陽性對照，設(shè)置4個復(fù)孔。在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待病毒對照病變達到80 % 時，每孔加入20 ?L MTT，置培養(yǎng)箱作用4 h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 ?L DMSO，預(yù)留4個空白校準(zhǔn)孔。用酶標(biāo)儀在與2.5.2下同樣的波長下測得細(xì)胞OD值，根據(jù)OD值計算出加藥后細(xì)胞的存活率。

細(xì)胞存活率=[（給藥組平均OD值-校準(zhǔn)組平均OD值）/（細(xì)胞對照組平均OD值-校準(zhǔn)組平均OD值）]×100%

3 ?實驗結(jié)果

3.1 ?蛋白質(zhì)含量比較

對所得數(shù)據(jù)進行t檢驗，得t =2.076， P>0.05，說明野生與養(yǎng)殖全蝎中蛋白質(zhì)的含量無顯著性差異，結(jié)果見表1。

3.2 ?糖胺聚糖含量比較

對所得數(shù)據(jù)進行t檢驗，得t=1.127， P>0.05，根據(jù)P值以及野生全蝎和家養(yǎng)全蝎的含量測定結(jié)果可以說明兩者糖胺聚糖的含量不存在明顯的差異，結(jié)果見表2。

3.3 ?醇提物顏色及含量比較

對于野生全蝎與養(yǎng)殖全蝎醇提物觀察，兩者隨顏色存在差異，但對三次測定的醇提物含量平均值并無太大差異，養(yǎng)殖全蝎略大于野生全蝎。實驗結(jié)果見表3。

3.4 ?抗病毒作用對比

對兩組全蝎水提液凍干后，進行抗病毒作用對比，可以得知養(yǎng)殖全蝎凍干粉水提取液對以下三種病毒的抑制抑制作用整體上優(yōu)于野生全蝎。其中，抗HSV效果差異較顯著，結(jié)果見圖1-3。

4 ?討 論

通過對野生全蝎和家養(yǎng)全蝎水提液蛋白、糖胺聚糖含量的測定，以及對其醇提物顏色和提取量的比較，可以得知野生全蝎和家養(yǎng)全蝎蛋白、糖胺聚糖含量以及醇提率都沒有明顯的差異，這與兩者酶解液中的結(jié)論是一致的。兩者醇提物比較中雖顏色有差別，但含量并無統(tǒng)計學(xué)上的意義。

在抗病毒作用比較中，對HSV病毒的抑制率，在高濃度條件下（>0.07 mg·mL-1）養(yǎng)殖全蝎明顯高于野生全蝎，具有顯著性的差異。在抗RSV中只有0.13 mg/kg時具有顯著性的差異，其他濃度均無差異。在EV71病毒中兩者在高濃度區(qū)（1 mg·mL-1）具有顯著性的差異。

綜合分析，養(yǎng)殖全蝎整體上優(yōu)于野生全蝎，可能是由于養(yǎng)殖全蝎的生長環(huán)境和飼養(yǎng)條件更為優(yōu)越，導(dǎo)致養(yǎng)殖全蝎中有效成分含量多于野生全蝎，致使其藥效高于野生全蝎。經(jīng)過系列比較野生與養(yǎng)殖全蝎在牛黃酸含量、酶解液抗腫瘤活性以及水提液抗病毒活性等方面的差異，可以初步確定用養(yǎng)殖全蝎代替野生全蝎是可行的，這對于保護生態(tài)環(huán)境和生物多樣性，提高全蝎臨床效果，發(fā)展動物藥養(yǎng)殖經(jīng)濟具有重大的現(xiàn)實意義。

參考文獻：

[1]張荒生， 王進軍. 中藥全蝎的藥理研究進展[J]. 中國中醫(yī)急癥， 2007 （02）： 224-226.

[2]桑曉， 王立娜， 姜悅， 等. HPLC柱前衍生化測定野生與養(yǎng)殖全蝎中游離?；撬岷縖J]. 化工時刊， 2017， 31 （03）： 21-24.

[3]桑曉，張瑞，王彥多，等.野生與養(yǎng)殖全蝎酶解后主要成分含量及抗腫瘤作用的對比研究[J].中南藥學(xué)，2018，16（02）：171-174.

[4]王舒玉， 曹廣超， 林偉江， 高世杰， 王集會. 正交試驗法優(yōu)化發(fā)酵蜣螂粉中水溶性蛋白的提取工藝[J]. 當(dāng)代化工， 2018， 47 （11）： 2334-2337.

[5]程曉薈，吳瑤瑤，趙延慧，等. 雌雄全蝎中蛋白質(zhì)及多糖含量的測定與比較[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 48 （3）： 130-132.

[6]劉春雨， 劉玉慧， 李曉輝， 鄭海珠， 孫景瑞， 藺葉桐， 王集會， 史磊.蜈蚣粉發(fā)酵前后水溶性活性物質(zhì)含量對比研究[J]. 湖南中醫(yī)雜志， 2016， 32 （11）： 167-169.

[7]熊雙麗， 金征宇. 硫酸化糖胺聚糖的簡易分光光度測定法[J]. 光譜實驗室， 2005 （06）： 176-179.

[8]中國藥典2015年版.四部[S].2015：202.

[9]張盼盼， 焦方文， 周建國， 韓春超， 王集會. 發(fā)酵全蝎粉酶解前后水提液抗病毒活性比較[J]. 中南藥學(xué)， 2016， 14 （03）： 267-269.

”