硫酸化羊肚菌多糖調(diào)控膽固醇代謝作用

唐瑜婉，張?jiān)虑?，?瑤，雷 琳，李富華,2，趙吉春,2，吳素蕊，明 建,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715；3.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

高脂血癥是引起心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一，其主要特征是血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和非高密度脂蛋白膽固醇（non-high-density lipoprotein cholesterol，non-HDL-C）水平升高。研究表明，他汀類、貝特類等降膽固醇藥物會(huì)帶來不良反應(yīng)或禁忌癥[1]。因此，近年來開發(fā)治療高脂血癥的天然脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑受到了越來越多的關(guān)注，黑脈羊肚菌（Morchella angusticepsPeck）就是其中之一。據(jù)報(bào)道，羊肚菌廣受歐洲、亞洲和北美地區(qū)歡迎，其多糖具有改善免疫功能、抑制微生物和腫瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)降血脂、抗氧化和抗疲勞等功效[2-7]。

多糖的生物活性主要受其單糖組成、主鏈的糖苷鍵、分支度、取代度和主鏈構(gòu)象的影響[8]。研究表明，多糖的羥基被硫酸基團(tuán)部分取代可以增強(qiáng)其生物活性[9-10]。本課題組前期報(bào)道了純化的水溶性黑脈羊肚菌多糖（polysaccharides fromMorchella angusticepsPeck，PMEP）及其羧甲基化衍生物的制備、結(jié)構(gòu)表征和生物活性[11-12]。對(duì)多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾已成為提高其生物活性的常用方法[13-14]。但是，目前鮮有關(guān)于硫酸化PMEP（sulfated PMEP，SPMEP）降血脂活性的研究。

本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)SPMEP和PMEP進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并研究其在高膽固醇血癥大鼠體內(nèi)的降膽固醇活性。同時(shí)，研究SPMEP和PMEP對(duì)血漿脂蛋白、短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）水平和膽汁酸排泄的影響。為探討其潛在機(jī)制，進(jìn)一步測(cè)定參與膽固醇代謝的酶和受體（包括3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase，HMG-CoA）、7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDL-R）和肝清除細(xì)胞B1受體（scavenger receptor class B member 1，SR-B1））的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性SD大鼠（SPF級(jí)），生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（軍）2011-0011，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

黑脈羊肚菌（Morchella angusticepsPeck） 昆明食用菌研究所；TG、TC、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測(cè)定試劑盒四川邁克生物科技公司；Western blotting試劑盒、載脂蛋白（apolipoprotein，Apo）AI、ApoB、卵磷脂膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase enzyme，LCAT）試劑盒 南京建成生物工程有限公司；膽汁酸試劑盒 上海研謹(jǐn)生物有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectrun100型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；MOS-450型圓二色光譜儀 法國(guó)Bio-Logic公司；3400N型掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；ModeIII5500型原子力顯微鏡 美國(guó)Agilent Technologies公司；GC-2010型氣相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 PMEP的制備

以黑脈羊肚菌（Morchella angusticepsPeck）為原料，烘干后經(jīng)過水提醇沉，過DEAE-52纖維素柱后層析，采用Sephadex G-100凝膠柱分離純化制得PMEP[11]。參考Reitz等[15]的氯磺酸吡啶法對(duì)PMEP進(jìn)行硫酸化修飾，并作適當(dāng)修改。制備硫酸酯化試劑：向冰浴的三角瓶中緩慢加入預(yù)冷無水吡啶，充分冷卻15 min，劇烈攪拌下向三頸瓶中滴加氯磺酸（每12 mL吡啶滴加1 mL氯磺酸）。取100 mg PMEP置于無水甲酰胺中磁力攪拌20 min，迅速75 ℃水浴攪拌1.5 h，反應(yīng)結(jié)束后加入50 mL預(yù)冷純水，加2.5 mol/L NaOH中和，自來水透析48 h，純水透析12 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，乙醇沉淀，冷凍干燥得SPMEP。

1.3.2 PMEP和SPMEP的表征

1.3.2.1 SPMEP取代度的測(cè)定

參考Zaleska等[16]的方法并稍作改進(jìn)，將100 mg SPMEP溶解在10 mL 1 mol/L HCl中，并于100 ℃水浴水解4 h，取1.0 mL消化液用1 mol/L鹽酸溶液稀釋至10 mL。再準(zhǔn)確量取0.5 mL稀釋液，加入7.50 mL三氯乙酸溶液和2.0 mL氯化鋇-明膠溶液，混勻后在真空條件下脫氣，然后在360 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，根據(jù)由硫酸鉀構(gòu)建的校準(zhǔn)曲線（其線性回歸方程為：y＝0.012 3x＋0.013 9，R2＝0.990 1）計(jì)算SPMEP的硫酸根含量。取代度根據(jù)下式計(jì)算。

式中：ω為SPMEP中硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1.3.2.2 FT-IR分析

通過KBr壓片法進(jìn)行PMEP和SPMEP的FT-IR光譜分析。將5 mg PMEP或SPMEP與100 mg KBr粉末混合充分研磨，然后分別壓片，在4 000～400 cm－1范圍進(jìn)行掃描[17]。

1.3.2.3 掃描電子顯微鏡觀察

分別稱取適量干燥的PMEP和SPMEP黏著于錫箔紙片上，將其置于真空噴鍍儀內(nèi)噴金、鍍導(dǎo)電層，采用3400N型掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察[18]。

1.3.2.4 圓二色光譜分析

將0.61 mg/mL PMEP和0.78 mg/mL SPMEP于180～500 nm范圍進(jìn)行圓二色光譜掃描，時(shí)間常數(shù)為1 s，狹縫寬度為1 nm，掃描點(diǎn)間隔為1 nm[14]。

1.3.2.5 原子力顯微鏡觀察

配制一定質(zhì)量濃度的PMEP和SPMEP，在3～4 nN、2 kHz條件下進(jìn)行原子力顯微鏡觀察。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

48 只雄性SD大鼠（（190±20）g），在溫度（25.0±0.5）℃、相對(duì)濕度（50±5）%、正常日夜循環(huán)條件下飼喂，實(shí)驗(yàn)前自由進(jìn)食飲水一周，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為6 組，分別按以下方式飼喂：模型（高脂）對(duì)照組（MC）：喂食高膽固醇飼料；陽性（藥物）對(duì)照組（PC）：喂食高膽固醇飼料，灌胃15 mg/（kg?d）的辛伐他汀藥物；PMEP低劑量組（PMEP-L）：喂食高膽固醇飼料，灌胃25 mg/（kg?d）的PMEP；PMEP高劑量組（PMEP-H）：喂食高膽固醇飼料，灌胃75 mg/（kg?d）的PMEP；SPMEP低劑量組（SPMEP-L）：喂食高膽固醇飼料，灌胃25 mg/（kg?d）的SPMEP；SPMEP高劑量組（SPMEP-H）：喂食高膽固醇飼料，灌胃75 mg/（kg?d）的SPMEP；高膽固醇飼料含有基礎(chǔ)飼料87.6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、膽固醇2%、豬油10%、豬膽鹽0.4%。

飼喂4 周后禁食12 h，在乙醚麻醉下斷頭取血，4 ℃，4 000 r/min離心5 min，收集血清。摘除肝臟，用冷生理鹽水清洗，吸干水分后稱質(zhì)量，然后在液氮中冷凍。取出小腸，收集內(nèi)容物真空冷凍干燥備用。收集實(shí)驗(yàn)最后3 d大鼠糞便，真空冷凍干燥后貯存?zhèn)溆?。所有樣品于?0 ℃條件貯存。

1.3.3.2 生化分析

參照Li Yao等[12]的方法用試劑盒測(cè)定血清中的TC、TG、HDL-C質(zhì)量濃度。TC質(zhì)量濃度與HDL-C質(zhì)量濃度的差即為non-HDL-C質(zhì)量濃度[19]。ApoAI、ApoB、LCAT質(zhì)量濃度采用試劑盒檢測(cè)。參考Folch等的方法[20]，用氯仿-甲醇溶液（體積比2∶1）提取肝臟TC和TG，用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。糞便和小腸總膽汁酸（total bile acids，TBA）含量采用試劑盒檢測(cè)。

1.3.3.3 肝組織學(xué)分析

將一部分肝組織用波恩試劑固定，貯存在體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中，石蠟包埋，然后用切片機(jī)切成5 μm厚的半脈血管組織切片[12]。載玻片用蘇木精和曙紅染色，使用配備Olympus B紅染色顯微鏡的高分辨率數(shù)碼相機(jī)獲得圖像。

1.3.3.4 Western blotting分析

取0.2 g肝臟組織全蛋白，采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。參考Burnette[21]的方法進(jìn)行Western blotting分析，并略作修改。蛋白質(zhì)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到Hybond-P聚偏二氟乙烯膜上。膜的非特異性結(jié)合位點(diǎn)被脫脂乳阻斷后，加入用一抗稀釋液稀釋200 倍體積的一抗（anti-HMGCoA-R或anti-LDL-R、anti-SR-B1、anti-CYP7A1），于4 ℃溫育過夜；洗滌膜，在二抗（用二抗稀釋液4 000 倍體積稀釋）中于4 ℃下再孵育1～2 h，顯影，通過Quantity One?軟件分析圖像。HMG-CoA、LDL-R、SR-B1和CYP7A1的質(zhì)量濃度用β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.3.5 SCFA含量分析

SCFA含量的測(cè)定參考Zhao Guohua等[22]的方法并略有修改。稱取大鼠糞便0.5 g，加入生理鹽水4 mL，均質(zhì)、離心，過有機(jī)濾膜后取上清液1 mL，加入11 μL內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（2-乙基丁酸）于－4 ℃條件下貯存?zhèn)溆?。用氣相色譜法對(duì)糞便中的SCFA組成及含量進(jìn)行分析。檢測(cè)條件如下：RTX-WAX柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），氫火焰離子檢測(cè)器，N2為載氣，壓力88 kPa。進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度200 ℃，分流進(jìn)樣，分流比25∶1，線速率26.4 cm/s?？偭髁?4.8 mL/min，柱流量0.91 mL/min，吹掃流量1.0 mL/min，柱溫100 ℃；平衡時(shí)間3.0 min；總程序時(shí)間17.5 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝8。利用Origin 8.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行不同動(dòng)物分組之間的方差分析和Duncan’s檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMEP及SPMEP的取代度及FT-IR分析結(jié)果

圖 1 PMEP及SPMEP的FT-IR圖譜Fig. 1 FT-IR spectra of PMEP and SPMEP

根據(jù)硫酸鉀構(gòu)建的校準(zhǔn)曲線（其線性回歸方程為：y＝0.012 3x＋0.013 9，R2＝0.990 1）計(jì)算得到SPMEP的硫酸根相對(duì)含量為39.04%，取代度為1.106 7。由圖1可知，PMEP和SPMEP的FT-IR均顯示在3 200～3 250 cm－1附近有典型的吸收峰，為O—H的伸縮振動(dòng)。硫酸化后，在2 960 cm－1附近出現(xiàn)新的吸收峰，為—CH2—（亞甲基）的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，在2 850.07 cm－1處增加的峰是—CH2—的對(duì)稱伸縮振動(dòng)。在1 046.77 cm－1處是O—SO2—O（硫酸基團(tuán)）中S＝O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，748.68 cm－1處是C—O—SO2中C—O—S的伸縮振動(dòng)，這一組峰是硫酸化多糖的特征吸收峰，說明PMEP硫酸化修飾成功。

2.2 PMEP及SPMEP的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖 2 PMEP（A）及SPMEP（B）的掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 Scanning electron micrographs of PMEP (A) and SPMEP (B)

利用掃描電子顯微鏡得到PMEP修飾前后的顯微成像（圖2），從而觀察二者的形貌差異。由圖2A可知，PMEP呈不對(duì)稱棒狀聚集態(tài)，由許多分子或基團(tuán)聚集而成的，表面粗糙不平，有許多小孔。由圖2B可知，SPEMP呈光滑碎片狀，表面積增大，多個(gè)片層緊密堆積，層次感強(qiáng)，說明經(jīng)過硫酸化修飾后，PMEP的分子間作用力增大，形成了更大的分子聚集體。

2.3 PMEP及SPMEP的圓二色光譜和原子力顯微鏡分析結(jié)果

圖 3 PMEP和SPMEP的圓二色光譜圖（A）和原子力顯微鏡圖（B、C）Fig. 3 Circular dichroism (A) and atomic force microscopic (B, C)images of PMEP and SPMEP

圖3A為PEMP和SPMEP的圓二色光譜圖。PMEP和SPMEP均在180～210 nm波長(zhǎng)之間具有正峰值，而SPMEP在182 nm和195.5 nm波長(zhǎng)左右有兩個(gè)負(fù)峰。說明經(jīng)過硫酸化修飾后PMEP在182 nm和195.5 nm波長(zhǎng)處增加了兩個(gè)負(fù)峰，使多糖分子發(fā)生不對(duì)稱的變化，這是硫酸基團(tuán)的貢獻(xiàn)結(jié)果，導(dǎo)致PEMP在溶液中的構(gòu)象發(fā)生了變化。

為獲得多糖的鏈結(jié)構(gòu)，采用三維原子力顯微鏡分別觀察了PEMP和SPMEP的形貌（圖3B、C）。和PMEP相比，SPMEP的振幅參數(shù)均較低，有更多不同尺寸的球形顆粒，其表面高峰變少，突起的陡峭度下降，高度分布差異變小，說明引入呈強(qiáng)電負(fù)性的硫酸基團(tuán)后，糖環(huán)構(gòu)象發(fā)生了扭曲或轉(zhuǎn)變，其排斥作用使多糖的卷曲構(gòu)象伸展，糖鏈伸長(zhǎng)，突起的陡峭度和高度下降。

2.4 PMEP及SPMEP對(duì)大鼠體質(zhì)量、采食量及飼料效率的影響

表 1 PMEP及SPMEP對(duì)大鼠體質(zhì)量、采食量及飼料效率的影響Table 1 Effects of SPMEP and PMEP on body mass gain and food intake of SD rats

由表1可知，與MC組相比，PMEP-L組、PMEP-H組、SPMEP-L組、SPMEP-H組大鼠體質(zhì)量增加量差異不顯著，PC組顯著升高（P＜0.05）。與MC組相比，PMEP-L組和PMEP-H組的飼料效率差異不顯著，SPMEP-H組的飼料效率上升。說明灌胃PMEP和SPMEP對(duì)高脂膳食大鼠的體質(zhì)量增加量影響不大，高劑量SPMEP能顯著提高高脂膳食大鼠的飼料效率。

2.5 PMEP及SPMEP對(duì)大鼠血清和肝臟指標(biāo)的影響

表 2 PMEP及SPMEP對(duì)大鼠血清和肝臟指標(biāo)的影響Table 2 Effects of SPMEP and PMEP on serum and liver parameters of SD rats

如表2所示，4 周后MC組大鼠血清TC、TG質(zhì)量濃度分別為92.85、117.75 mg/dL，而PC組（辛伐他?。┠茱@著阻止血清TC質(zhì)量濃度（下降約22%）和TG質(zhì)量濃度（下降約23%）的升高（P＜0.05）。SPMEP在阻止血清TC質(zhì)量濃度（71.26～78.50 mg/dL）和TG質(zhì)量濃度（86.44～91.72 mg/dL）升高方面比PMEP（TC質(zhì)量濃度（79.13～82.75 mg/dL）、TG質(zhì)量濃度（90.77～97.45 mg/dL））更有效（P＜0.05）。與MC組相比，PC、PMEP、SPMEP組血清HDL-C、ApoAI、LCAT質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05），ApoB質(zhì)量濃度顯著降低。高脂飲食引起肝臟脂質(zhì)堆積，與MC組相比，辛伐他汀、PMEP-H、SPMEP-H均能顯著降低肝臟TC（分別降低28.05%、23.08%、28.52%）、TG（分別降低14.79%、10.15%、10.57%）含量，SPMEP顯著升高肝臟LCAT質(zhì)量濃度（P＜0.05）。

2.6 PMEP及SPMEP對(duì)大鼠糞便和腸道中SCFA和TBA含量的影響

表 3 PMEP及SPMEP對(duì)大鼠糞便和腸道中SCFA和TBA含量的影響Table 3 Effects of SPMEP and PMEP on the contents of fecal shortchain fatty acids and intestinal bile acids in SD rats

由表3可知，PC、SPMEP和PMEP組中乙酸、丙酸、異丁酸和丁酸含量均顯著低于MC組（P＜0.05）。此外，SPMEP-H組中丙酸、異丁酸和丁酸含量顯著高于PMEP-H組（P＜0.05）。與MC組相比，PC、PMEP和SPMEP組糞便TBA的排泄量增加（P＜0.05），然而，只有PC和SPMEP組腸道TBA含量顯著增加（P＜0.05）。

2.7 PMEP及SPMEP對(duì)大鼠CYP7A1、HMG-CoA、SR-B1、LDL-R蛋白表達(dá)及肝臟組織的影響

圖 4 PMEP及SPMEP對(duì)大鼠肝臟CYP7A1（A）、HMG-CoA（B）、SR-B1（C）、LDL-R（D）的表達(dá)水平及肝組織形態(tài)（E）的影響Fig. 4 Effects of PMEP and SPMEP on hepatic protein expression levels of CYP7A1 (A), HMG-CoA (B), SR-B1 (C), and LDL-R (D) as well as morphological changes (E) in SD rats

與MC組相比，喂食辛伐他汀、PMEP和SPMEP可上調(diào)大鼠肝臟CYP7A1的表達(dá)（圖4A）；然而，除PMEP-L組之外，其他組大鼠肝臟HMG-CoA的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖4B）；僅PC組和SPMEP-H組肝臟LDL-R的表達(dá)顯著增加（P＜0.05）（圖4D）。圖4E顯示，在大鼠的染色肝組織中觀察到白色液滴形式的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累。與MC組相比，加入辛伐他汀、SPMEP和PMEP均可以預(yù)防肝臟脂質(zhì)積聚的增加。

3 討 論

FT-IR、圓二色光譜和原子力顯微鏡分析結(jié)果表明，PMEP硫酸化修飾成功，其原始結(jié)構(gòu)、光學(xué)活性和構(gòu)象發(fā)生了明顯變化。一方面，1 150～1 240 cm－1附近的弱峰表明存在吡喃糖[23]，在1 046.77 cm－1處是O—SO2—O（硫酸基團(tuán)）中S＝O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)[14]（圖1）；另一方面，原子力顯微鏡分析表明PMEP和SPMEP的顆粒粒徑高度大于單鏈多糖（約0.1～1 nm），說明存在分子間和/或分子內(nèi)聚集[24]（圖3B、C）。SPMEP鏈上的硫酸基團(tuán)具有較強(qiáng)的分子間和分子內(nèi)相互作用[25]。掃描電子顯微鏡作為一種強(qiáng)有力的工具，有助于更好地了解多糖的基本物理性質(zhì)。先前有研究報(bào)道了類似的蘑菇多糖和微生物多糖的多孔網(wǎng)狀微結(jié)構(gòu)[26]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)硫酸化處理后，多糖片段的外觀改變?yōu)橐?guī)則的均勻結(jié)構(gòu)。不同的多糖和硫酸化過程中所涉及的反應(yīng)可能在影響硫酸多糖的外觀方面發(fā)揮重要作用[14,25]。

本課題組前期研究表明，PMEP具有降低大鼠血清TC水平的潛力[11]，這與本研究結(jié)果一致。此外，SPMEP在降低大鼠血脂方面的能力強(qiáng)于PMEP，這與前人的研究結(jié)果[27-28]一致。本研究表明，SPEMP通過降低血清TC、TG、non-HDL-C水平，增加HDL-C水平，從而有利地改變血清脂蛋白水平。與MC組相比，SPMEP-H組糞便和腸道TBA含量增加28%～86%，而PMEP組僅增加9%～18%（表3），表明SPMEP在降低膽固醇方面比其天然結(jié)構(gòu)更有效。細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成的調(diào)控和膽汁排泄在調(diào)節(jié)膽固醇體內(nèi)平衡中起重要作用。

辛伐他汀是一種通過下調(diào)肝臟HMG-CoA、同時(shí)上調(diào)LDL-R表達(dá)而降低血漿脂質(zhì)水平的藥物，通常用作對(duì)照[29]。本研究結(jié)果顯示肝臟HMG-CoA（一種負(fù)責(zé)膽固醇合成的限速酶）表達(dá)量在PC、PMEP和SPMEP組中降低（圖4B）。相反地，在PMEP和SPMEP組中，LDL-R（一種負(fù)責(zé)血清LDL膽固醇攝取的受體）的表達(dá)呈增加趨勢(shì)（圖4D）[30-31]。與MC組相比，SPMEP-H組血清TC質(zhì)量濃度降低23%，肝臟TC質(zhì)量濃度降低29%，而PMEP僅使血清TC質(zhì)量濃度降低11%～15%，肝臟TC質(zhì)量濃度降低15%～23%（表2）。CYP7A1是一種將肝臟TC轉(zhuǎn)化為膽汁酸的限速酶，有助于降低血清TC水平[32]。結(jié)果顯示，辛伐他汀和高劑量SPMEP引起肝臟CYP7A1的表達(dá)分別顯著增加了26%和28%，而高劑量PMEP使肝蛋白表達(dá)增加19%（圖4A）。

PMEP和SPMEP都會(huì)被腸道菌群部分或全部發(fā)酵，主要發(fā)酵終產(chǎn)物為SCFA，如乙酸、異丁酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等[33]，這些SCFA通過抑制肝臟膽固醇合成來降低血清膽固醇濃度，例如限制HMG-CoA的作用或增加LDL-C的分解代謝[34]。本研究中，PC組、SPMEP組、PMEP組的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸含量均顯著低于MC組（P＜0.05）（表3）。并且除乙酸外，SPMEP-H組的丙酸、異丁酸和丁酸含量均顯著高于PMEP-H組（P＜0.05）（表3）。這可以部分解釋SPMEP降膽固醇能力比PMEP強(qiáng)的原因[35]。

4 結(jié) 論

從黑脈羊肚菌中提取的PMEP經(jīng)硫酸化修飾獲得取代度為1.106 7的SPMEP，對(duì)SPMEP和PMEP進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，發(fā)現(xiàn)兩者具有不同的光學(xué)活性和構(gòu)象。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明：與PMEP相比，SPMEP降低血清TC、TG、non-HDL-C、ApoB水平和增加HDL-C、ApoAI、LCAT水平的效果更強(qiáng)，具有更好的降低大鼠血清膽固醇的能力。同時(shí)，SPMEP降低了糞便SCFA含量、提高了糞便和腸道TBA含量，其機(jī)制可能是通過下調(diào)肝臟HMG-CoA表達(dá)、上調(diào)肝臟CYP7A1、LDL-R表達(dá)介導(dǎo)。綜上，PMEP通過硫酸化修飾可以增強(qiáng)降低大鼠膽固醇含量的活性，這可能為SPMEP作為一種天然化合物應(yīng)用于預(yù)防高脂血癥提供思路。