醫(yī)用銀離子抗菌水凝膠敷料的制備及性能研究

朱新華 黃春蘭 吳麗莎 李雄杰

摘? ? ? 要： 將納米銀與水凝膠兩者性能結合，制備醫(yī)用銀離子抗菌水凝膠敷料，并對其性能進行研究。不使用分散劑，采用水凝膠的納米孔吸附銀離子的方式制備納米銀，使用殼聚糖、冰醋酸、納米銀、泊洛沙姆、碳酸氨、甘油六種試劑制備納米銀抗菌凝膠，并采用類似的方式制備納米銀抗菌凝膠敷料。分別對制備得到的水凝膠敷料進行UV-vis 分析，并測試其抗菌性、溶脹性和生物相容性。實驗結果表明，在不添加分散劑和還原劑的條件下，硝酸銀可以被還原成納米銀，表明納米銀制備方法可行;水凝膠對大腸桿菌的最大抑菌圈為4.20 mm左右，對葡萄球桿菌的最大抑菌圈為3.52 mm左右，均具有良好的抗菌效果，且納米銀的添加，更加增強了水凝膠的抗菌性;相較于其他甘油含量的水凝膠敷料，添加2%甘油的敷料具有更好的溶脹性;銀離子抗菌水凝膠敷料具有較好的生物相容性，在促進細胞增殖分化方面具有無可比擬的優(yōu)勢。

關? 鍵? 詞：納米銀;水凝膠;敷料;制備

中圖分類號：TQ 317? ? ? ?文獻標識碼： A? ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2019）10-2257-04

Abstract： A medical silver ion antimicrobial hydrogel dressing was prepared by combining the properties of nano silver and hydrogel， and its properties were studied. Nanoscale silver was prepared without dispersant through adsorption of silver ions by nanopores of hydrogel. Nano silver antibacterial gel was prepared from six kinds of reagents， including chitosan， glacial acetic acid， nano silver， poloxamer， carbonic acid ammonia and glycerol， and nano silver antibacterial gel dressing was prepared in a similar way. The prepared hydrogel dressings were analyzed by UV-vis， and their antibacterial activity， swelling ability and biocompatibility were tested. The experimental results showed that silver nitrate was reduced to nano-silver without dispersant and reductant， which indicated that the preparation method of nano-silver is feasible; the maximum inhibitory zone of hydrogel to E.coli was about 4.20 mm， and the maximum inhibitory zone to Staphylococcus was about 3.52 mm， and the addition of nano-silver enhanced the antimicrobial activity of hydrogel. Compared with other glycerol content hydrogel dressings， the dressings with 2% glycerol had better swelling ability; silver ion antimicrobial hydrogel dressings had better biocompatibility， and had incomparable advantages in promoting cell proliferation and differentiation.

Key words： Silver nanoparticles; Hydrogel; Dressing; Preparation

醫(yī)用敷料是指覆蓋于皮膚傷口創(chuàng)面上，用以保護傷口，避免感染的材料，可作為短時間內(nèi)皮膚的替代品，醫(yī)用敷料能夠為傷口創(chuàng)面營造一個低氧的微環(huán)境，有助于促進傷口的愈合。醫(yī)用敷料在傷口護理中是必不可少的，我國對醫(yī)用敷料的需求量巨大，但國內(nèi)醫(yī)院采用的新型敷料大多需要從國外進口，成本較高，我國需要加強新型敷料的研發(fā)[1，2]。隨著材料學和組織工程研究的發(fā)展，眾多新型敷料脫穎而出，其中水凝膠敷料的性能最為突出，能夠在水中溶脹，大量吸收水分但又不會溶解于水，也正是因為高含水性，水凝膠可以變換為多種形式，用于各類型創(chuàng)傷。此外，其生物相容性也明顯優(yōu)于其他材料敷料，且具有更低的換藥頻率[3]。

醫(yī)用銀離子通常為納米銀，粒徑小于100 nm，屬于無機抗菌材料，對多種病菌以及病毒等都具備較強的殺傷作用，并且具有很好的抗耐藥性，在外科領域應用廣泛[4，5]。但納米銀材料的抗菌及時性較低，具有一定的遲滯性，且對于革蘭氏陽性菌的抑制性能較弱，為此，本文聯(lián)合水凝膠制備敷料，對醫(yī)用銀離子抗菌水凝膠敷料的制備及性能進行研究。

1? 實驗部分

1.1? 試劑與原料

實驗中需要使用的試劑與原料如表1所示。

1.2? 納米銀制備

首先，準備4 mL硝酸銀溶液（2 mg/mL），在磁力作用攪拌下，向其中添加30 mg聚乙烯砒咯烷酮，攪拌至兩者相融合，形成相溶液。然后，在相溶液中滴加4 mL硼氫化鈉溶液（0. 18 mg/mL），速度不宜過快，在正常室溫條件下放置1 h，即可得到1 mg/mL的橘黃色納米銀溶液[6]。最后，采用超聲技術，使用蒸餾水稀釋納米銀溶液，使其濃度稀釋至40μg/mL。

許多納米銀制備方法中，都會加入分散劑，以保證納米銀溶液較好的分散性和穩(wěn)定性。本文在納米銀制備過程中，不使用分散劑，采用水凝膠的納米孔來吸附銀離子，以發(fā)揮同樣的作用。此外，還會依據(jù)孔徑大小合理調(diào)整納米銀的尺寸，使其尺寸保持中等水平，從而很好的平衡納米銀抗菌能力和體外細胞毒性水平[7，8]。在納米銀制備中同樣不使用還原劑，使用溶菌酶分子鏈上固有的還原基因?qū)︺y離子進行還原，以替代還原劑的作用。

1.3? 納米銀抗菌水凝膠制備

使用殼聚糖、冰醋酸、納米銀、泊洛沙姆、碳酸氨、甘油六種試劑制備納米銀抗菌凝膠。鑒于冰醋酸是用于溶解殼聚糖的試劑，不需要對其濃度進行確定，對于泊洛沙姆而言，在制備水凝膠過程中，其粘稠度等性能指標變化范圍不大，也可以忽略對其濃度的確定[9]。因此，本研究主要對殼聚糖、碳酸氨和甘油3種試劑的濃度進行確定。分別制備5組樣品，在其中兩種試劑濃度和用量不變的條件下，通過改變剩余一種試劑的濃度來觀察納米銀抗菌水凝膠的變化，選取出最佳表現(xiàn)效果的試劑濃度作為本研究中該試劑的濃度。殼聚糖的濃度最終確定值為2.1%（wt），碳酸氨的濃度最終確定為0.10 mol/L，甘油濃度最終確定為3%。

對上述試劑處理完成后，選取5個含有刻度的燒杯，進行編號，標記為1-5號，在每個燒杯中均加入15 mL的蒸餾水，并同時加入250 μL的冰醋酸。然后，在1-5號燒杯中，分別加入0、200、400、600、800 μL的之前制備的納米銀溶液，滴加500μL的甘油，充分攪拌使其溶解。接下來，分別向1-5號燒杯中添加60 mg的泊洛沙姆和0.53 g的殼聚糖，充分攪拌使其均勻，放置一個晚上，直至其充分溶脹并排除氣泡[10]。最后，分別向1-5號燒杯中滴加2 mL碳酸氨溶液，充分攪拌使其均勻，滴加蒸餾水，使其形成溶膠狀態(tài)，靜置幾天使其形成凝膠，使其定容至25 mL，配置完成。

1.4? 銀離子抗菌水凝膠敷料制備

本研究中采用甘油為變量，制備銀離子抗菌水凝膠敷料。與水凝膠制備流程相似，選取1-5號的含刻度燒杯[11]。首先，分別加入15 mL蒸餾水、250μL的冰醋酸和0.2 mL濃度為40μg/mL的納米銀溶液，充分攪拌至均勻，加入0.2、0.4、0.5、0.6 mL的甘油，適當加熱，攪拌均勻，再加入60 mg的泊洛沙姆，充分攪拌使其溶解。然后，加入0.53 g的殼聚糖并攪拌使其均勻，在1-5號的燒杯中分別加入濃度為2 mol/L碳酸氨溶液，攪拌均勻后滴入蒸餾水，使其定容至25 mL。最后，放置過夜消除氣泡后，將1-5號燒杯中的溶膠放置在特定設備內(nèi)，使其形成凝膠，再利用干燥器對其進行干燥處理，則可形成敷料。

1.5? 測試與表征

1.5.1? UV-vis 分析

利用紫外-可見分光光度計[12]對濃度為40μg/mL的納米銀溶液進行 UV-vis分析。

1.5.2? 水凝膠敷料的抗菌性測試

分別稱取瓊脂（2 g）和牛肉膏（1 g），添加蒸餾水使其溶解，并適當加熱直至融化。放置溶液使其在自然條件下冷卻至室溫，再向其中添加NaoH溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，高壓滅菌20 min。待溶液冷卻至50 ℃，分別加入大腸桿菌和葡萄球桿菌，待溶液冷卻形成培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中注入水凝膠敷料樣品，樣品中的納米銀數(shù)量設置為不同組別，數(shù)量依次增加，恒溫培養(yǎng)1周，溫度控制在36 ℃左右，測量抑菌圈尺度。

1.5.3? 水凝膠敷料的溶脹性測試

水凝膠敷料浸入水中后，體積因水分子進入而膨脹，膨脹部分重量與原重量的比值即為溶脹率。準確稱量干凝膠敷料質(zhì)量，添加0.53 g的殼聚糖，將溫度控制在36 ℃左右進行溶脹實驗。以2%、4%、6%、8%的甘油為測試變量，設置時間間隔為10 min，在不同間隔時間點取出各組水凝膠，使用濾紙擦除表面水分，稱量水凝膠敷料重量。

1.5.4? 水凝膠敷料的生物相容性測試

采用直接接觸法來測試水凝膠敷料的生物相容性。取水凝膠敷料樣品放置于80%的乙醇中進行滅菌處理，將滅菌處理后的水凝膠敷料放置于24目孔板上。

選取三角形態(tài)的纖維細胞進行細胞種植，采用細胞計數(shù)板統(tǒng)計細胞數(shù)量，設置合理的細胞密度，同時對其進行稀釋處理。稀釋完成后，再種植到放置水凝膠的24目孔板上，在36 ℃恒溫條件下，對將稀釋后細胞放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，時間設置為40 h，使用顯微鏡對細胞在水凝膠表面的分布情況以及細胞活性進行觀察并記錄。

2? 結果與討論

2.1? UV-vis 分析結果

圖1為納米銀溶液的UV-vis譜圖。

根據(jù)圖1 可知，在波長為400 nm處，出現(xiàn)了一個曲線峰，即為納米銀離子的共振峰。表明在不添加分散劑和還原劑的條件下，硝酸銀能夠被還原成納米銀，驗證了本文制備納米銀方法的可行性。

2.2? 水凝膠敷料的抗菌性測試結果

在大腸桿菌和葡萄球桿菌培養(yǎng)基中注入水凝膠后，兩者的擴散圖像如圖2所示。

根據(jù)圖2可知，水凝膠對大腸桿菌和葡萄球桿菌的抗菌效果都比較明顯，具有很好的抗菌作用。經(jīng)測試可知，水凝膠對大腸桿菌的最大抑菌圈為4.20 mm左右，水凝膠對葡萄球桿菌的最大抑菌圈為3.52 mm左右，相對于普通材料產(chǎn)生的抑菌圈更大。還可以觀察到，抑菌圈的直徑隨著銀離子抗菌水凝膠敷料中納米銀的加入量不斷增大，即水凝膠的抗菌性能在不斷增加。

2.3? 水凝膠敷料的溶脹性測試結果

以2%、4%、6%、8%的甘油為變量，得到水凝膠敷料的溶脹性測試結果，如圖3。

根據(jù)圖3可知，在任意時間段，2%甘油的水凝膠敷料溶脹性均高于其他變量條件下的溶脹性，2%甘油的水凝膠敷料溶脹性最低可達到60%，最高可達到160%，2%甘油的水凝膠敷料溶脹性平均值約為100%，其他三組均在40%左右，由此可以看出，2%甘油的水凝膠敷料具有更好的液體吸收能力。

2.4? 水凝膠敷料的生物相容性測試結果

三角形態(tài)的纖維細胞在水凝膠表面的分布情況如圖4所示。

根據(jù)圖4可知，水凝膠表面的纖維細胞密度相對較小，但細胞的粘附和增值效果仍舊保持良好的狀態(tài)，完全伸展狀態(tài)下的細胞多數(shù)呈現(xiàn)出紡錘形或星形的形態(tài)，徑長與正常細胞保持一致，表明該水凝膠敷料材料具有很好的生物相容性，并未釋放出任意帶有毒性的物質(zhì)，因此，以銀離子抗菌水凝膠制備出來的敷料具有良好的性能，可以有效促進細胞的增殖和分化。

3? 結論與展望

本文對醫(yī)用銀離子抗菌水凝膠敷料的制備以及性能進行了分析，對制備得到的水凝膠敷料進行UV-vis 分析，并選取抗菌性、溶脹性和生物相容性為指標對該水凝膠敷料性能進行分析。結果表明，該水凝膠敷料具有很好的抗菌性，添加2%甘油的敷料溶脹性最好，且該水凝膠敷料生物相容性良好，可促進細胞生長。

為更全面的表征所制備的水凝膠敷料的性能，在以后的研究，會選取更多的性能指標進行分析。

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