超聲波輔助酶法提取‘蜜本南瓜’水不溶性膳食纖維工藝優(yōu)化及理化性質(zhì)測定

摘? ? 要： 通過初選酸法、堿法和超聲波輔助酶法提取‘蜜本南瓜水不溶性膳食纖維（Insoluble dietary fiber，IDF），選用酶法進(jìn)行提取試驗。結(jié)果顯示，料液比、超聲時間、木瓜蛋白酶酶解溫度對南瓜IDF得率的影響較其他單因素顯著。進(jìn)一步響應(yīng)面試驗優(yōu)化得出IDF的最佳提取工藝參數(shù)是：液料比14.5 mL·g-1、超聲時間15 min和木瓜蛋白酶酶解溫度60.67 ℃，在此條件下南瓜IDF的得率可達(dá)29.99±0.1%。經(jīng)理化測定，‘蜜本南瓜IDF的持水力為（7.10±0.05） g·g-1，持油力為（1.03±0.09） g·g-1，膨脹力為（5.52±0.08） mL·g-1。IDF中游離酚含量為（187.97±0.20） mg GAE·100 g-1，結(jié)合酚含量（82.62±0.14） mg GAE·100 g-1。此外，IDF對·OH、DPPH·和O2-·均有一定的清除能力，與其所含酚類的成分有關(guān)。綜上，超聲波輔助酶法提取南瓜IDF方法切實可行，產(chǎn)品具有良好的理化特性，是一種天然的抗氧化膳食纖維，發(fā)展前景廣闊。

關(guān)鍵詞： 南瓜; IDF; 超聲波輔助酶法; 工藝優(yōu)化; 理化性質(zhì)

Abstract： By comparing the method of acid， alkaline， and ultrasonic assisted enzymatic extraction of Insoluble dietary fiber （IDF） from Cucurbita moschata Duch.， the enzymatic method was chosen in this test. The results showed that the ratio of solid to liquid， ultrasonic time， enzymatic temperature of papain were more significant than other single factors on the yield of IDF. Through further response surface optimization experiments， the optimal extraction parameters of pumpkin IDF were as follows： liquid-to-liquid ratio 14.5 mL·g-1， ultrasonic time 15 min and papain digestion temperature 60.67 ℃. Under this condition， the extract yield of IDF can be high of （29.99±0.1）%. By the determination of managerial properties， the water holding capacity of IDF was （7.10±0.05） g·g-1， the oil holding power was （1.03±0.09） g·g-1， the expansion force was （5.52±0.08） mL g-1. The content of free phenol in pumpkin IDF was （187.97±0.20） mg GAE·100 g-1 and the bound phenol content was （82.62±0.14） mg GAE·100 g-1. Besides， Pumpkin IDF had the ability to scavenge ·OH， DPPH· and O2-·， which may be due to the phenolic compounds. In summary， the ultrasound-assisted enzymatic extraction method of pumpkin IDF was feasible， and the product not only had good physicochemical properties， but also can be characterized as natural antioxidant dietary fiber， which was of broad prospects for development.

Key words： Cucurbita moschata Duch.; Insoluble dietary fiber; Ultrasonic assisted enzymatic method; Process optimization; Physicochemical property

南瓜是葫蘆科南瓜屬植物，適應(yīng)性強(qiáng)，易栽植，我國南瓜產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的3/10（約1.8×107 t），居全球第二，資源非常豐富[1]?！郾灸瞎希–ucurbita moschata Duch.）是我國常見的南瓜品種，其糖度和粉度均高于普通品種，營養(yǎng)豐富，且具有諸多生物學(xué)功效[2]。尤其是南瓜中豐富的膳食纖維能夠有效調(diào)節(jié)膳食營養(yǎng)平衡，保障身體健康，比如減肥、降血糖、降血脂[3]、提高免疫能力以及預(yù)防結(jié)腸癌等胃腸道疾病等[4]。據(jù)報道，植物性膳食纖維已被證實具有顯著的抗氧化活性[5]，并且已廣泛應(yīng)用于食品保鮮與功能食品研發(fā)等領(lǐng)域[6]。目前，針對于膳食纖維提取的報道既有傳統(tǒng)的酸法、堿法，又有綠色化學(xué)法[7]、發(fā)酵法[8]、聯(lián)合酶解法[9]、輔助酶解法[10]等，但是近3年國內(nèi)對于南瓜中膳食纖維提取的研究較少。因此，筆者以中國常見品種‘蜜本南瓜為研究對象，不僅比較了常用酸法、堿法、酶法對IDF得率的影響，還進(jìn)一步優(yōu)化了液料比、糖化酶酶溶液用量、糖化酶酶解溫度、糖化酶酶解時間、超聲時間、木瓜蛋白酶酶解溫度及酶解時間7個單因素，以期獲得簡單易行的提取工藝參數(shù)。同時，通過對提得‘蜜本南瓜的IDF進(jìn)行理化指標(biāo)分析，以期為其研發(fā)利用提供理論依據(jù)和創(chuàng)新基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘蜜本南瓜由大閩生物科技（漳州）有限公司選育，糖化酶、木瓜蛋白酶：20 000 U·g-1，由河南亞統(tǒng)食品原料有限公司提供;沒食子酸、硫酸亞鐵·七水合物、福林酚、鄰苯三酚為AR級，由麥克林公司提供;抗壞血酸、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基為AR級，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

試驗于2018年9—10月在閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實驗室進(jìn)行。將同一批次的‘蜜本南瓜進(jìn)行清洗、切片后，于60 ℃鼓風(fēng)烘干，粉碎過60目篩，制得南瓜粉末，放入密閉干燥的容器保存?zhèn)溆谩?/p>

粗蛋白的測定參考GB 5009.5-2016 中的凱氏定氮法處理，使用自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定。氨基酸的測定參考GB 5009.124-2016處理，使用氨基酸分析儀進(jìn)行測定。粗脂肪的測定參考GB5009.6-2016，使用索氏提取法進(jìn)行測定。可溶性糖的測定參考Liobera 等[11]方法。

以IDF得率為指標(biāo)，比較以下3種提取方法的得率高低，并選擇一種較優(yōu)的方法進(jìn)行優(yōu)化。

堿法：參考丁莎莎等[12]方法。按液料比20 mL·g-1加入40 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaOH溶液，60 ℃水浴提取1 h，5 000 r·min-1離心15 min，洗滌并收集濾渣，干燥稱重得IDF。

酸法：參考郭寶顏等[13]方法。調(diào)整pH=4，60 ℃恒溫水浴1 h，5 000 r·min-1離心15 min，洗滌并收集濾渣，干燥后得IDF，稱重計算得率。

超聲波輔助酶法：參考李建周等[14]方法略微修改。按照料液比20 mL·g-1加入去離子水，126 W超聲處理5 min，調(diào)節(jié)pH為4.0～4.4，加入50 mg·mL糖化酶溶液0.5 mL，混合均勻并用保鮮膜密封，60 ℃水浴酶解50 min，再調(diào)節(jié)pH至6.0～8.0，添加50 mg·mL的木瓜蛋白酶溶液0.5 mL，攪拌均勻后用保鮮膜密封，60 ℃水浴45 min，而后5 000 r·min-1離心15 min，濾渣洗滌后烘干稱重，計算得率。

1.2.1 單因素試驗 （1）液料比對南瓜IDF得率的影響

考察料液比10、15、20、25、30 mL·g-1對南瓜IDF得率的影響。其他反應(yīng)條件為：超聲時間15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解溫度60 ℃、糖化酶酶解時間50 min、木瓜蛋白酶酶解溫度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解時間45 min。

（2）超聲時間對南瓜IDF得率的影響

考察超聲時間取5、10、15、20、25 min時對南瓜IDF得率的影響。其他反應(yīng)條件為：料液比15 mL·g-1、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解溫度60 ℃、糖化酶酶解時間50 min、木瓜蛋白酶酶解溫度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解時間45 min。

（3）糖化酶溶液用量對南瓜IDF得率的影響

考察糖化酶溶液添加量為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL時對南瓜IDF得率的影響。其他反應(yīng)條件為：料液比15 mL·g-1、超聲時間15 min、糖化酶酶解溫度60 ℃、糖化酶酶解時間50 min、木瓜蛋白酶酶解溫度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解時間45 min。

（4）糖化酶酶解溫度對南瓜IDF得率的影響

考察糖化酶酶解溫度取50、55、60、65、70 ℃時對南瓜IDF得率的影響。其他反應(yīng)條件為：料液比15 mL·g-1、超聲時間15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解時間50 min、木瓜蛋白酶酶解溫度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解時間45 min。

（5）糖化酶酶解時間對南瓜IDF得率的影響

考察糖化酶酶解時間為10、30、50、70、90 min時對南瓜IDF得率的影響。其他反應(yīng)條件為：料液比15 mL·g-1、超聲時間15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解溫度 55 ℃、木瓜蛋白酶酶解溫度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解時間45 min。

（6）木瓜蛋白酶酶解溫度對南瓜IDF得率的影響

考察木瓜蛋白酶酶解溫度在50、55、60、65、70 ℃時對南瓜IDF得率的影響。其他反應(yīng)條件為：料液比15 mL·g-1、超聲時間15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解溫度 55 ℃、糖化酶酶解時間30 min、木瓜蛋白酶酶解時間45 min。

（7）木瓜蛋白酶酶解時間對南瓜IDF得率的影響

考察木瓜蛋白酶酶解時間為15、30、45、60、75 min，對南瓜IDF得率的影響。其他反應(yīng)條件為：料液比15 mL·g-1、超聲時間15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解溫度 55 ℃、糖化酶酶解時間30 min、木瓜蛋白酶酶解時間45 min。

1.2.2 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定料液比（A）、超聲時間（B）和木瓜蛋白酶酶解溫度（C）3個對南瓜IDF得率影響比較顯著的因素，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗表（表1），優(yōu)選南瓜IDF提取的最佳工藝。

1.2.3 最優(yōu)組合驗證試驗 按理論最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗證試驗。

1.2.4 南瓜IDF理化性質(zhì)的測定 （1） 持水力

稱取1.000 g提得IDF粉末（M0）于100 mL燒杯中，按料液比40 mL·g-1加入40 mL去離子水，混勻后靜置1 h，3 500 r·min-1離心0.5 h，傾去上清液，濾渣甩干水分后稱重（M1）[15]。

持水力（WHC）=[M1（g）-M0（g）]/M0（g），單位g·g-1。

（2）持油力

取1.000 g IDF粉末（ K0）于50 mL 的離心管中，按比例25 g/g加入大豆油25 g，37 ℃靜置1 h，3 000 r·min-1離心20 min，倒掉表層油脂，剩下的油脂及樣品用20目篩網(wǎng)過濾，用濾紙吸去多余油脂，稱得質(zhì)量K1[16]。

持油力=（K1-K0）/K0，單位：g·g-1。

（3）膨脹力

稱取0.5 g IDF粉末（m）置于量筒中，按料液比30 mL·g-1加入15 mL去離子水，攪拌均勻，室溫靜置1天，讀取量筒中IDF膨脹后的體積數(shù)（V），最后將膨脹后的體積除去粉末樣品質(zhì)量[17]。

膨脹力=V/m，單位：mL·g-1。

（4）游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的提取和測定

①游離酚提?。悍Q取1.00 g IDF粉末于100 mL離心管中，按料液比50 mL·g-1加入80%的冷凍丙酮溶液50 mL-1，閃式浸取10 min，3 500 r·min-1下離心10 min，反復(fù)提取殘渣，收集合并上清液，將上清液旋轉(zhuǎn)濃縮，在45 ℃下濃縮至低于10 mL，再用甲醇定容于25 mL，并在-80 ℃下保藏直至測定[18]。

②結(jié)合酚提取：按料液比40 mL·g-1加入40 mL鹽酸-甲醇1.2 mol·L-1溶液和2 mg抗壞血酸抗氧化劑與提取完游離酚的樣品殘渣在35 ℃下水浴振蕩16 h，過濾取濾液在45 ℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，再用甲醇定容至25 mL，而后在-80 ℃下保存直至分析[19]。

③酚含量的測定：移取0.2 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或適當(dāng)稀釋后的多酚樣品提取液于10 mL比色管中，再加入超純水0.8 mL，隨后加入0.2 mL福林酚試劑，混合均勻，放置6 min后再加入7%的碳酸鈉溶液1.0 mL，最后用蒸餾水定容至5 mL，室溫下反應(yīng)90 min后，波長760 nm處，測定吸光值A(chǔ)i，酚含量用沒食子酸當(dāng)量（mg GAE·100 g-1）表示[20]。

多酚含量（mg GAE·100 g-1）=C×V/m。

V-提取液總體積（mL），M-樣品質(zhì)量m（g），C-每毫升提取液中南瓜不溶性膳食纖維中總多酚含量（mg·mL-1）

（5）清除羥基自由基（·OH）能力的測定

參考Cotelle等[21]方法，取3.0 mL的2.50 mmo1·L-1鄰二氮菲溶液和2.0 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖液并混勻，再加入1.0 mL的1.0 mL·L-1 H2O2和15.0 mmo1·L-1 FeSO4溶液0.5 mL，再用去離子水定容至10.0 mL，37 ℃恒溫水浴1 h，在510 nm 處測定吸光度λ1;之后分別加濃度不同的試樣溶液1 mL，再加l.0 mL·L-1的H2O2 1.0 mL-1，未損害管不需要加l.0 mL·L-1 H2O2和提取物，分別得到吸光度λ2、λ0。

·OH清除率的計算如下：清除率/%=（λ2-λ1）/（λ0-λ1）×100。

式中：λ0-未損害管，λ1-損害管，λ2-加提取物。

（6）清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測定

參考張志旭等[22]方法，取10 mL-1的比色管加入4.5 mL Tris-HCI緩沖溶液并在20 ℃中水浴20 min，再分別加1 mL不同濃度的試樣溶液和25 mmo1·L-1鄰苯三酚溶液0.4 mL，混合均勻，水浴25 ℃反應(yīng)5 min，再加入8 mo1·L-1的鹽酸1 mL，299 nm處測定吸光度A1，空白對照用超純水水代替樣品液，測定吸光度A0。

O2-·清除率的計算如下：O2-·清除率/%=（A0-A1）×100/A0。

（7）清除DPPH·能力的測定

參考李繼仁等[23]方法，分別各取2 mL濃度不同樣品液于10 mL比色管中，加入2.0 mL 2×10-4 mol·L-1 DPPH溶液，混勻反應(yīng)0.50 h，517 nm處測定吸光值，還有測定超純水替代樣品液的空白樣品、樣品空白的吸光值。

DPPH·抑制率的計算如下：抑制率/%=[A0-（A1-A2）]×100/A0

式中：A0—乙醇2.0 mL+ DPPH溶液2.0 mL的吸光值;

A1—DPPH溶液2.0 mL+ 樣品液2.0 mL的吸光值;

A2—樣品液2.0 mL+乙醇2.0 mL的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 16.0和Design Expert 7.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。方差分析用Turkeys HSD 進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料化學(xué)組成分析

‘蜜本南瓜中的粗蛋白、粗脂肪及可溶性糖的含量如表2所示，氨基酸組成見表3，氨基酸評分（AAS）和氨基酸比值（RAA）見表4。

2.2 不同方法對IDF得率的影響

酸法、堿法、酶法都是常用的IDF提取方法，化學(xué)法提取最為快速簡便[24]，水提法得率較低，但操作簡易，環(huán)境污染小;酶法提取條件溫和，雜質(zhì)殘留少，適合淀粉、蛋白質(zhì)含量高的原料;酶法輔助提取兼具兩種提取方式的長處，不僅得率高，酸堿使用量較少，降低對IDF中活性物質(zhì)影響，可得純度和活性較高的IDF[25]。從圖1可知，超聲波輔助酶法的提取效果較佳，堿法次之，酸法的得率較差。故筆者將進(jìn)一步優(yōu)化超聲波輔助酶法工藝。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 液料比對南瓜IDF得率的影響 從圖2能夠看出，當(dāng)液料比為15 mL·g-1時南瓜IDF得率達(dá)到最大值27.82%，之后隨著料液比的增加南瓜IDF的得率顯著降低。

3 結(jié) 論

采用超聲波輔助酶法提取南瓜IDF的最佳工藝為：料液比14.5 g·mL-1、超聲時間15 min、糖化酶酶溶液用量500 μL·g-1，糖化酶酶解溫度55 ℃，木瓜蛋白酶酶解時間30 min，木瓜蛋白酶酶解溫度60.67 ℃，此時，南瓜IDF的得率最大為（29.99±0.1）%，與理論預(yù)測值相近，方法可行。此外，通過理化性質(zhì)測定，所提南瓜IDF持水力為（7.10±0.05） g·g-1，持油力為（1.03±0.09） g·g-1，膨脹力為（5.52±0.08） mL·g-1;其結(jié)合酚含量為（82.62±0.14） mg GAE·100 g-1，游離酚含量為（187.97±0.20） mg GAE·100 g-1;IDF具有顯著的·OH、O2-·、DPPH·的清除能力，是一種具有生物活性的天然抗氧化膳食纖維，具有廣闊的市場前景。

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