酒燉白芷中總香豆素及4種香豆素類成分的含量測(cè)定

朱春璐 王靜 喬宇航 謝鑫榮 袁子民

【摘 要】目的：建立酒燉白芷中總香豆素及4種香豆素成分的含量測(cè)定方法，并比較炮制對(duì)其含量的影響。方法：總香豆素的測(cè)定采用紫外分光光度法，以歐前胡素為對(duì)照品，測(cè)定波長(zhǎng)為300 nm;4種香豆素類成分含量采用HPLC法，色譜柱為（4.6 mm×250 mm，5 μm）為迪瑪C18，以甲醇-水（70∶30）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。結(jié)果：總香豆素測(cè)定中歐前胡素在1.92～19.20 μg·mL-1內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為97.2%，RSD=1.3%;4種香豆素類成分測(cè)定中氧化前胡素、歐前胡素、8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯及異歐前胡素分別在0.013～0.26 μg、0.016～0.32 μg、0.0082～0.164 μg、0.0085～0.17 μg內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率在97.0%～99.2%，RSD<2.20%。結(jié)論：所建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于酒燉白芷的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】酒燉白芷;總香豆素;氧化前胡素;歐前胡素;8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯;異歐前胡素

【中圖分類號(hào)】R248.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A?【文章編號(hào)】1007-8517（2019）19-0027-03

Abstract：Objective To estabish the methods for determining total coumarins and four coumarin constituents in Angelicae dahuricae Radix processed with yellow rice wine， and then compare the processing effect on the contents of these compounds. Methods Total coumarins were determined by UV， an UV method was developed at 300 nm， using imperatorin as a reference substance. Four coumarin constituents were determined by HPLC，the column named Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used for the chromatographic separation. Methanol-Water（70∶30）was determined as the mobile phase. The flow-rate was set to 1.0 mL·min-1;The detection wavelength was set at 300 nm. The column temperature was fixed at 30 ℃. Results The linear range of imperatorin was 1.92 ～ 19.20 μg·mL-1， and the average recovery was 97.2% and the relative standard deviation （RSD） was 1.3% in the determination of total coumarin. The linear relationships of Oxypeucedanin， imperatorin， cnidilin and isoimperatorin were good in the range of 0.013～0.26 μg， 0.016～0.32 μg， 0.0082～0.166 μg and 0.0085～0.17 μg， respectively. The average recovery was 97.0% and 99.2%， and the RSD was less than 2.20%. Conclusions The methods were simple， accurate and reproducible， and could be used for the determination of these compounds in the Angelicae dahuricae Radix processed with yellow rice wine.

Key?words：Angelicae dahuricae Radix processed with yellow rice wine;total coumarins;oxypeucedanin; imperatorin;cnidilin;isoimperatorin

白芷具有解表散寒，祛風(fēng)止痛等功效。古代白芷的炮制品有醋炒、酒炒、酒浸、蒸制、酒蒸等多種炮制方法，其酒制后可增強(qiáng)白芷祛風(fēng)散寒、消腫排膿作用[1]。都梁丸收載于2015版《中國(guó)藥典》，用于風(fēng)寒瘀血阻滯脈絡(luò)所致的頭痛，該方君藥為酒燉白芷[2]，其炮制目的及對(duì)藥效成分的影響研究甚少，文獻(xiàn)報(bào)道[3-6]白芷中總香豆素、氧化前胡素、歐前胡素、8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯及異歐前胡素具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙等藥理作用。因此，本文建立了酒燉白芷中總香豆素及4種香豆素含量測(cè)定方法，并比較酒燉前后對(duì)其藥效成分的影響，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及炮制機(jī)理的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1?儀器與試藥

U-3010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本日立公司）; Agilent1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）;KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。白芷三批（祁白芷，河北安國(guó)），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.的干燥根;氧化前胡素、8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，HPLC檢測(cè)純度均≥98%;甲醇為色譜純，水為純凈水。

2?方法與結(jié)果

2.1?酒燉白芷的制備?取藥材除去雜質(zhì)，大小分開(kāi)，略浸，潤(rùn)透，切厚片，干燥，得白芷飲片。取白芷飲片，加入黃酒（每100 Kg白芷加入黃酒20 Kg），悶潤(rùn)時(shí)間為0.5 h，隔水蒸制時(shí)間為5 h，干燥，即得。

2.2?總香豆素的含量測(cè)定

2.2.1?對(duì)照品溶液的制備?取歐前胡素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成19.2 μg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.2.2?供試品溶液制備?分別取白芷、酒燉白芷粉末（過(guò)20目篩）約0.2 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 KHz）1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.2.3?線性關(guān)系考察?分別精密量取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、5.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成系列濃度對(duì)照品溶液，以甲醇為空白，在300 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.0443x+0.0096（r=0.9994）。結(jié)果歐前胡素濃度在1.92～19.20 μg·mL-1內(nèi)線性良好。

2.2.4?精密度試驗(yàn)?取同一供試品溶液，以甲醇為空白，在300 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)6次，結(jié)果RSD為1.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.5?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一酒燉白芷飲片樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，以甲醇為空白，分別在300 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為1.58%，RSD為1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取同一酒燉供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h以甲醇為空白，在300 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為1.25%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7?回收率試驗(yàn)?分別取已知含量的同一酒燉白芷飲片粉末（總香豆素含量為1.60%）0.1 g，精密稱定，各6份，分別精密加入歐前胡素對(duì)照品溶液（濃度為192 μg·mL-1）8.0 mL，再精密加入甲醇17.0 mL，其余按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液。依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果回收率在96.2%～99.4%之間，平均回收率為97.2%，RSD為1.3%，符合相關(guān)規(guī)定。

2.2.8?樣品含量測(cè)定?取3批白芷及其炮制的酒燉白芷樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3?4種香豆素的含量測(cè)定

2.3.1?色譜條件?色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-水（70∶30）;流速：1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.2?混合對(duì)照品溶液的制備?分別取4種香豆素對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含歐前胡素0.8 mg、8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯0.82 mg、異歐前胡素0.85 mg、氧化前胡素0.65 mg的對(duì)照品溶液備用。分別精密量取歐前胡素、氧化前胡素對(duì)照品溶液各2.0 mL及8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯、異歐前胡素對(duì)品溶液各1.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3?供試品溶液制備?分別取白芷、酒燉白芷粉末（過(guò)20目篩）約0.2 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 KHz）1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，分別取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4?線性關(guān)系考察?分別精密量取上述“2.3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.10、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表1，各成分線性關(guān)系良好。

2.3.5?精密度試驗(yàn)?取同一酒燉供試品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果4種香豆素峰面積的RSD分別為1.4%、1.6%、1.8%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.3.6?穩(wěn)定性試驗(yàn)?分別精密吸取同一酒燉供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果4種香豆素峰面積的RSD分別為1.3%、1.5%、1.8%、1.9%，表明8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一酒燉樣品各6份，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并依法測(cè)定并計(jì)算RSD，結(jié)果4種香豆素含量的RSD分別為1.2%、1.6%、1.4%、1.7%，表明重復(fù)性良好。

2.3.8?回收率試驗(yàn)?精密稱取已知含量的酒燉白芷粉末約0.1 g，精密稱定，平行6份，分別按樣品含量加入4種香豆素對(duì)照品溶液適量，按2.3.3項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定含量，結(jié)果4種香豆素的平均回收率分別為98.4%、99.2%、97.0%、97.2%，RSD分別為1.8%、1.7%、2.3%、2.3%，表明回收率試驗(yàn)良好，符合有關(guān)規(guī)定。

2.3.9?樣品含量測(cè)定?取3批白芷及其炮制的酒燉白芷，按2.3.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3?討論

將4種香豆素類對(duì)照品溶液、供試品溶液分別在200～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果均在300 nm處有最大吸收，因此選擇300 nm作為總香豆素及4種香豆素類成分含量測(cè)定的波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用等度洗脫，4種香豆素類成分均能達(dá)到較好的分離，便于測(cè)定。

有文獻(xiàn)研究表明川白芷樣品熏硫前后多種香豆素類成分的含量有較大損失[7]，表明香豆素類成分穩(wěn)定性較差。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)酒燉（隔水蒸制）炮制后總香豆素含量增加，但4種香豆素類成分含量均有所下降，可能與黃酒的弱酸性、受熱及蒸汽中水的作用下使成分轉(zhuǎn)化有關(guān)[8-9];但總香豆素含量增加，可能與新的香豆素類成分的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)化成其他成分后紫外吸收增強(qiáng)有關(guān);另外，由于成分含量的變化，可能對(duì)藥效作用產(chǎn)生改變，這與都梁丸中白芷采用酒燉炮制后入藥，增強(qiáng)治療偏頭痛藥效是否一致，還需進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2019-07-09?編輯：劉斌）