米櫧天然林和桔園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化

鄭裕雄 ，曹際玲 ，楊智杰 *，林成芳 ，黃夢青 ，楊玉盛

1. 福建師范大學(xué)/濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，福建 福州 350007；2. 福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350007

微生物是森林土壤中最為活躍的組分，能對土壤性質(zhì)和環(huán)境脅迫的變化迅速作出反應(yīng)，在土壤碳氮循環(huán)過程中起到至關(guān)重要的作用（Xiong et al.，2014）。目前，大部分研究表明植被類型能顯著改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。韓世忠等（2015）利用磷脂脂肪酸（PLFA）研究兩種森林植被類型對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異主要由植被類型差異引起，天然林土壤磷脂脂肪酸總量和各類群特征脂肪酸含量高于人工林。Potthast et al.（2012）研究發(fā)現(xiàn)植被類型變化能顯著改變土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分有效性，牧草場土壤真菌和革蘭氏陰性菌豐度顯著高于天然林。Wang et al.（2017）在海南島研究發(fā)現(xiàn)植被類型變化能顯著改變微生物群落組成及其功能，其中橡樹人工林細(xì)菌和叢枝菌根真菌豐度顯著低于熱帶雨林。此外，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對植被類型變化的響應(yīng)還受到季節(jié)性差異的影響。羅達(dá)等（2014）在南亞熱帶人工林發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受到林分類型和季節(jié)的雙重因素影響，其旱季土壤微生物類群和總PLFA顯著高于雨季。而 Vorí?ková et al.（2014）在研究土壤微生物的季節(jié)動態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)，夏季真菌生物量較春季增加了3倍，與植物光合產(chǎn)物的地下分配趨勢一致。亞熱帶地區(qū)氣象變化復(fù)雜，森林凋落物、土壤溫度和水分等因素的季節(jié)變化影響，導(dǎo)致不同季節(jié)間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異更加顯著（鄭裕雄等，2018），但果園受到除草翻耕、灌溉和施肥等人工管理措施的影響，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對季節(jié)變化產(chǎn)生如何響應(yīng)以及是否明顯仍不清楚。

長期以來，為取得經(jīng)濟(jì)發(fā)展，滿足人們的需求，大面積常綠闊葉天然林經(jīng)皆伐、煉山和整地后改造為桔園等果園，已使亞熱帶山區(qū)的植被類型發(fā)生了巨大的變化（楊智杰等，2010）。福建省現(xiàn)有果園面積5.42×105hm2，占全國果園面積的4.17%，相比森林生態(tài)系統(tǒng)，果園生態(tài)系統(tǒng)受到人為干擾的強(qiáng)度和頻度更為強(qiáng)烈，其對生態(tài)系統(tǒng)碳平衡起著重要作用（王超等，2012）。本研究以位于福建建甌萬木林自然保護(hù)區(qū)內(nèi)保存較為完整的天然林為對照，選取臨近由天然林轉(zhuǎn)變而來的桔園為研究對象，采用PLFA分析技術(shù)探討亞熱帶山區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對不同植被類型響應(yīng)的季節(jié)動態(tài)特征，分析植被類型變化對土壤微生物環(huán)境響應(yīng)力的影響，為維護(hù)土壤生態(tài)功能穩(wěn)定和促進(jìn)山區(qū)資源的可持續(xù)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣地概況

研究區(qū)設(shè)在福建省建甌市萬木林自然保護(hù)區(qū)（27°03′N，118°09′E），地處武夷山脈東南坡，屬中亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年均氣溫 19.4 ℃，年均降水量1731 mm（主要集中在4—6月），年均蒸發(fā)量1466 mm，相對濕度81%。保護(hù)區(qū)地貌為東南低山丘陵，土壤為發(fā)育在花崗巖和片麻巖之上的南方山地黃紅壤。

試驗(yàn)地林分基本特征如表1所示。天然林以米櫧（Castanopsis carlesii）為主要建群種，喬木層由薄葉山礬（Symplocos anomala）、木荷（Schima superba）、浙江桂（Cinnamomum chekiangense）、絲栗栲（Castanopsis fargesii）及臺灣冬青（Ilex formosana）等組成。草本層以狗脊（Woodwardia japonica）和草珊瑚（Sarcandra glabra）為主。桔園是為 1985年天然林皆伐后人工種植形成，定期施肥，年施肥量0.35 t·hm-2，以復(fù)合型化肥NPK為主，旱季灌溉，每年除草翻耕 2—3次，病蟲害時(shí)適當(dāng)噴灑農(nóng)藥。土壤基本理化性質(zhì)為：天然林 pH 5.28，容質(zhì)量（容重）0.74 g·cm-1，土壤有機(jī)碳68.26 t·hm-2，水解氮 147 mg·kg-1，有效磷 2.11 mg·kg-1，年凋落物量5.96 t·hm-2；桔園pH 4.53，容質(zhì)量（容重）1.14 g·cm-1，土壤有機(jī)碳 42.87 t·hm-2，水解氮119 mg·kg-1，有效磷 10.20 mg·kg-1，年凋落物量 2.65 t·hm-2（楊玉盛等，2007；黃夢清，2013）。

1.2 樣品采集

在米櫧天然林和桔園各隨機(jī)設(shè)置立地條件基本相似的3個(gè)20 m×20 m標(biāo)準(zhǔn)樣地，各相鄰兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)地之間的緩沖區(qū)相隔至少10 m。采用S形5點(diǎn)取樣法，分別于 2012年的春季、夏季、秋季和冬季（2013年1月）采集4次土樣，先將土壤表層枯枝凋落物去除，再用土鉆采集表層0—10 cm土壤，將每塊標(biāo)準(zhǔn)地的土樣混勻成1個(gè)土樣，用冰袋保存將其運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。于24 h內(nèi)挑去根系、凋落物和碎石等，于-80 ℃冰箱保存，待土壤磷脂脂肪酸測定。

1.3 微生物群落結(jié)構(gòu)

磷脂脂肪酸（PLFA）根據(jù) Frosteg?rd et al.（1993）方法命名，PLFA及微生物類型見表2。

采用溫和堿性甲酯化方法（Schutter et al.，2000）進(jìn)行PLFA提取，簡單操作步驟：稱取10 g冷凍干燥后的鮮土，放于50 mL離心管中，加入23 mL提取液（6 mL氯仿，12 mL甲醇，5 mL磷酸緩沖液），渦旋振蕩20 s，超聲10 min，重復(fù)3次，離心（20 ℃，2500 r·min-1，10 min）后轉(zhuǎn)移上層清液到另一個(gè)干凈的50 mL離心管，剩余土壤重復(fù)上述步驟進(jìn)行二次提取，將兩次提取液合并后充分混勻，在黑箱靜置一夜（8 h）。收集下層氯仿相，用 N2吹干，通過硅膠柱分離出磷脂。最后進(jìn)行甲基化，加入1 mL甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）洗吹干樣，渦旋 30 s，再加入 1 mL KOH溶液（0.2 mol·L-1），80 r·min-1低速振蕩 5 min 后，在 37 ℃水浴鍋中水浴10 min，再依次加入3 mL冰醋酸溶液（1 mol·L-1）、10 mL 正己烷，充分搖勻離心（4 ℃，2000 r·min-1，15 min）后，轉(zhuǎn)移上清液（正己烷相）到干凈試管，再向剩余溶液中加入10 mL正己烷重新浸提，轉(zhuǎn)移上層清液到試管，將兩次溶解有脂肪酸的己烷溶液合并后充分混勻，氮吹干。用 1 mL甲基叔丁基醚-正己烷溶液（1:1，V/V）洗至樣品瓶中，-20 ℃冰箱保存。上機(jī)前，用19:0甲酯作為內(nèi)標(biāo)溶液，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）（7890A-5973C，Agilent，USA）進(jìn)行PLFA的測定。

表1 試驗(yàn)地林分基本特征Table 1 Stand characteristics of study plantations

表2 土壤微生物種群磷脂脂肪酸標(biāo)記物及其特征比值Table 2 The markers and characteristic ratio of PLFA in soil

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用香農(nóng)-威納（Shannon-Wiener）豐富度指數(shù)和辛普森（Simpson）優(yōu)勢度指數(shù)來表征土壤微生物多樣性（徐贏華等，2010）。

Shannon指數(shù)：

Simpson指數(shù)：

式中，ni是第i種個(gè)體數(shù)；N是所在群落所有物種個(gè)體數(shù)之和。

參照Luo et al.（2006）的方法計(jì)算響應(yīng)率，以天然林微生物類群PLFA為對照，研究植被類型變化導(dǎo)致土壤微生物類群分異的特定 PLFA。當(dāng)響應(yīng)率數(shù)值大于0，表征微生物類群特定PLFA對植被類型變化呈正響應(yīng)；小于0，則呈負(fù)響應(yīng)。

數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用雙因素方差分析法（Two-way，ANOVA）分析植被類型、季節(jié)及其交互作用對各指標(biāo)的影響，采用 Tukey多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），繪圖由Origin 9.0完成。運(yùn)用Canoco 5.0對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行主成分分析（PCA）。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物 PLFA含量變化的影響

從圖1可知，天然林和桔園土壤微生物主要以細(xì)菌為優(yōu)勢類群，分別占微生物總 PLFA含量的41.04%和48.01%。天然林微生物類群PLFA含量全年均顯著高于桔園，其中桔園夏季微生物類群PLFA含量下降幅度最大，達(dá)到 69.3%。天然林和桔園土壤微生物類群PLFA含量隨著季節(jié)變化均顯著下降，微生物類群最高PLFA含量均出現(xiàn)在春季，而天然林微生物類群最低PLFA含量出現(xiàn)在冬季，桔園夏季PLFA含量最低。

圖1 兩種植被類型土壤微生物PLFA含量的季節(jié)變化Fig. 1 Seasonal variation of PLFA content of soil microorganisms in two vegetation types

2.2 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物特征比值的影響

從圖 2可知，天然林春季 F:B比桔園顯著低18.74%，而夏、秋和冬季比桔園分別顯著高61.45%、52.04%和57.99%。天然林春季G+:G-比桔園顯著高出19.40%，夏季比桔園顯著低42.01%，而秋冬季節(jié)無顯著差異。天然林全年 Cy:Pre均顯著高于桔園，平均高出66.31%。天然林春夏季節(jié)Iso:Ant比桔園分別顯著低8.96%和13.36%，而秋冬季節(jié)無顯著差異。天然林和桔園Cy:Pre和Iso:Ant隨季節(jié)變化均表現(xiàn)為先上升后下降，在夏季出現(xiàn)最大值。

2.3 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物群落多樣性的影響

從表3可知，天然林夏季土壤微生物群落豐富度指數(shù)比桔園顯著低1.63%，而優(yōu)勢度指數(shù)比桔園顯著高30.75%，這表明天然林夏季土壤微生物群落多樣性顯著低于桔園。天然林春季土壤微生物群路豐富度指數(shù)比桔園顯著高1.16%，而優(yōu)勢度指數(shù)比桔園顯著低3.82%，這表明天然林夏季土壤微生物群落多樣性顯著高于桔園。天然林和桔園土壤微生物群落豐富度指數(shù)最低值均出現(xiàn)在夏季，冬季優(yōu)勢度指數(shù)均最高，這表明兩種植被冬季土壤微生物群落多樣性最高，而夏季多樣性最低。

表3 植被類型變化對不同季節(jié)土壤微生物群落多樣性的影響Table 3 Effects of vegetation types change on soil microbial community diversity in different seasons

2.4 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

圖2 兩種植被類型土壤微生物PLFA特征比值的季節(jié)變化Fig. 2 Seasonal variation of PLFA characteristic ratio of soil microorganisms in two vegetation types

圖3 植被類型和季節(jié)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響主成分分析Fig. 3 Principal component analysis (PCA) of the effects of vegetation type on soil microbial community structure relative to season

利用主成分分析法進(jìn)一步分析植被類型和季節(jié)變化對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。從圖3可知，主成分 1（PC1）對類群 PLFA 變異的解釋率達(dá)56.70%，主成分2（PC2）的解釋度達(dá)到21.86%，共同解釋變異的78.56%。天然林與桔園不同季節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著分異。

對影響天然林和桔園季節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分進(jìn)行得分值計(jì)算（表4），在主成分1和主成分2中，植被類型和季節(jié)雙因素主成分得分值均具有明顯差異性，表明季節(jié)和植被類型雙因素變化對微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。

表4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主成分得分值的差異顯著性分析（F值）Table 4 Significance analysis of the difference between principal components of the soil microbial community in score value (F value)

從表5可知，除季節(jié)未對F:B產(chǎn)生顯著影響，季節(jié)變化和植被類型雙因素均對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的影響，這表明土壤微生物群路對植被類型變化的響應(yīng)隨著季節(jié)變化會發(fā)生顯著變異。

2.5 植被類型對不同季節(jié)土壤微生物群落特定PLFA的影響

以天然林特定PLFA為對照，利用響應(yīng)率曲線進(jìn)一步分析造成桔園和天然林土壤微生物群落差異的特定PLFA。從圖4可知，桔園不同季節(jié)的土壤微生物群落特定PLFA含量基本均顯著低于天然林，不同 PLFA含量的差異幅度不同。除 16:1w7t、Cy:17:00和Cy:19:00外，桔園春季其余細(xì)菌PLFA標(biāo)記物豐度顯著下降導(dǎo)致細(xì)菌豐度下降的幅度高于天然林，而真菌 18:1w9t標(biāo)記物豐度顯著增加導(dǎo)致真菌豐度下降的幅度低于天然林。桔園春季G+標(biāo)記物豐度顯著下降導(dǎo)致 G+豐度下降的幅度高于天然林，而G-細(xì)菌Cy:17:00、16:1w7t和18:1w7t標(biāo)記物豐度增加導(dǎo)致G-豐度下降的幅度低于天然林。

表5 季節(jié)和植被類型變化及其相互作用對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的顯著性分析Table 5 Significance analysis of the effects of vegetation types change，season and their interactions on soil microbial community structure

圖4 植被類型變化對土壤微生物特定PLFA季節(jié)動態(tài)的影響（95%的置信區(qū)間）Fig. 4 Effects of vegetation types change on seasonal dynamics of soil microbial specific PLFA at a 95% confidence interval

3 討論

土地覆被的變化是土壤微生物變化的驅(qū)動力，通過改變凋落物、根系分泌物及有機(jī)碳等影響土壤養(yǎng)分貯存和底物有效性。本研究發(fā)現(xiàn)，相比天然林，桔園土壤微生物類群PLFA含量顯著降低，這可能與桔園管理措施改變土壤地下碳分配，進(jìn)而影響土壤底物有效性有關(guān)。前期研究（Yang et al.，2003；郭劍芬等，2006）也發(fā)現(xiàn)，果園年凋落物量比天然林下降5.83%，細(xì)根生物量也顯著降低。陳香碧等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，與原生林地相比，受人為干擾的生態(tài)系統(tǒng)土壤細(xì)菌豐度顯著下降。隨著桔園長期施肥，土壤pH降低，土壤酸化抑制了土壤微生物生長和活性，降低類群PLFA含量。張逸飛等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，種植單一樹種和農(nóng)業(yè)管理措施造成土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量下降，導(dǎo)致土壤酸化，對土壤微生物群落造成負(fù)面影響。此外，桔園土壤長期種植單一作物，受除草翻耕和施肥等人為管理措施影響較大，導(dǎo)致地上植被覆蓋率低，根系分泌物多樣性較低，進(jìn)而定向選擇出能很好適應(yīng)其環(huán)境的土壤微生物，導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性下降。鄧嬌嬌等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，人工林和農(nóng)業(yè)用地土壤養(yǎng)分急劇下降，總碳源的利用能力降低，從而造成微生物群落多樣性降低。本研究中，夏季桔園微生物多樣性顯著高于天然林，這可能是與地表植被增加有關(guān)。杜毅飛等（2015）研究生草果園時(shí)發(fā)現(xiàn)地上植被增加能為果園土壤輸入大量凋落物及其根系分泌物，改變土壤理化性質(zhì)，提高了土壤微生物對碳源的利用能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)和植被類型變化能顯著改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)（圖3）。天然林和桔園土壤微生物類群最高PLFA含量均出現(xiàn)在春季，天然林微生物類群最低PLFA含量出現(xiàn)在冬季，桔園夏季含量最低。李南潔等（2017）在縉云山柑橘林研究時(shí)發(fā)現(xiàn)季節(jié)更替對土壤微生物有顯著影響，類群PLFA含量均表現(xiàn)出春季最高，夏冬季節(jié)含量最低，這可能受到土壤溫度和水分變化影響造成的。不同季節(jié)微生物類群特定PLFA含量下降幅度不同，會導(dǎo)致微生物對環(huán)境變化的響應(yīng)能力以及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性變化的響應(yīng)程度不同。桔園夏、秋和冬季F:B顯著低于天然林，這與葉晶等（2016）研究發(fā)現(xiàn)耕地F:B比值和土壤穩(wěn)定性顯著低于黃山松林地的結(jié)果相同。但本研究中春季桔園F:B顯著高于天然林（圖 2），表明春季桔園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高于天然林。這主要因?yàn)榇杭緭Q葉期凋落物量降低，減弱地表林冠層和凋落物淋溶作用；同時(shí)，處于生長季的桔樹將大量光合作用產(chǎn)物用于增加細(xì)根生物量，從土壤吸收大量養(yǎng)分供植物生長換葉，導(dǎo)致根系向土壤輸送的易分解有機(jī)碳大量減少。土壤中富營養(yǎng)型的細(xì)菌因可利用的易分解有機(jī)碳含量大量減少而降低，貧營養(yǎng)型的真菌分解利用土壤中低營養(yǎng)和難分解的木質(zhì)素等高碳氮比有機(jī)質(zhì)維持自身代謝（Blagodatskaya et al.，2007；Ingwersen et al.，2008），生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性增加。春季桔園G+:G-比值顯著高于天然林，表明春季降低桔園土壤營養(yǎng)脅迫壓力。春季細(xì)根周轉(zhuǎn)迅速，G-易于利用根系凋落物進(jìn)行代謝（Moore-Kucera et al.，2008），而夏季 G-標(biāo)記物豐度下降幅度大于G+，這可能與土壤溫度有關(guān)。桔樹低矮且林冠郁閉度較天然林低，夏季溫度高，土壤水分蒸發(fā)快，陽光可直射透過林冠和地表稀少的草本層加快土壤溫度的上升，也會限制G-生長。楊林等（2016）在高山森林模擬增溫對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究，發(fā)現(xiàn)溫度升高顯著降低土壤有機(jī)層G-標(biāo)記物含量，引起G+:G-升高。

此外，土壤微生物群落可通過改變某些特殊脂肪酸含量來響應(yīng)植被變化導(dǎo)致的環(huán)境脅迫。Cy:Pre反映土壤微生物所處的養(yǎng)分壓力狀態(tài)，其值越高表示微生物對養(yǎng)分競爭越厲害。本研究發(fā)現(xiàn)，天然林和桔園微生物最大Cy:Pre均出現(xiàn)在夏季，表明夏季土壤微生物類群對養(yǎng)分競爭激烈。Moore-Kuceraet al.（2008）研究不同林齡黃杉土壤微生物群落結(jié)構(gòu)季節(jié)動態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)，夏季微生物Cy:Pre增加，這主要受到水分壓力變化造成的脅迫影響。桔園全年Cy:Pre顯著低于天然林（圖2），主要是Cy19:00標(biāo)記物豐度下降造成（圖4），這可能是桔園土壤中易被利用分解的有機(jī)碳含量降低，導(dǎo)致微生物類群對養(yǎng)分的競爭減弱。楊東偉等（2018）在中國浙江研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，相較于水田，桔園耕層土壤微生物的養(yǎng)分脅迫和所處壓力增強(qiáng)，微生物數(shù)量降低，這主要與天然林轉(zhuǎn)變?yōu)榻蹐@后土壤養(yǎng)分含量不均衡有關(guān)。Iso:Ant反映微生物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)力，其值越高表示土壤微生物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)力越強(qiáng)。天然林春夏季節(jié) Iso:Ant顯著低于桔園，表明天然林微生物對養(yǎng)分需求的競爭對其抵抗環(huán)境變化的能力產(chǎn)生負(fù)面影響。

4 結(jié)論

植被類型對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生較大影響。天然林土壤微生物類群PLFA含量全年顯著高于桔園，但不同季節(jié)土壤微生物變化類群不同，變化程度也不同，即植被類型變化對土壤微生物類群的影響表現(xiàn)出一定的季節(jié)差異性。此外，植被類型顯著改變土壤微生物群落 F:B和春夏季G+:G-，并使不同結(jié)構(gòu)的環(huán)丙烷脂肪酸或異構(gòu)脂肪酸等特殊脂肪酸比值發(fā)生改變，表明季節(jié)變化在一定程度上改變土壤微生物群落對環(huán)境變化的抵抗能力。