玉米淀粉產(chǎn)酒精的復(fù)合酶制劑研究*

王晨， 馬文勤， 紀(jì)鈞麟， 鄭鑫， 賈正燕,夏迎春， 尹芳， 張無(wú)敵

(云南師范大學(xué) 能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,太陽(yáng)能研究所，云南 昆明 650500)

玉米作為我國(guó)境內(nèi)主要播種的農(nóng)作物之一，被廣泛用于酒精生產(chǎn)，但玉米中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(如植酸、纖維素和果膠多糖等)[1]和有機(jī)物質(zhì)(如淀粉、粗蛋白質(zhì)及粗脂肪等)[2]對(duì)傳統(tǒng)酒精生產(chǎn)中的水解和糖化存在一定影響，使得玉米中的還原糖利用率達(dá)不到理想要求.淀粉類(lèi)原料產(chǎn)酒率的提高主要有提高發(fā)酵料液還原糖含量和提高酵母菌活性?xún)蓷l途徑，復(fù)合酶制劑是將兩種以上酶制劑按一定比例混合用于提高出酒率和縮短發(fā)酵周期的酶添加劑.研究針對(duì)現(xiàn)酒精行業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中⑴玉米原料淀粉的利用率低，大分子生物成分降解不完全[3]；⑵玉米原料中的纖維素、果膠多糖、植酸和粗蛋白未被充分利用；⑶現(xiàn)有的高效復(fù)合酶制劑大范圍使用成本較高等問(wèn)題，結(jié)合玉米原料的特性，選定了纖維素酶[4]、果膠酶、植酸酶[5]和酸性蛋白酶[6]等低成本酶制劑作為協(xié)同試劑，利用雙酶法[7]發(fā)酵生產(chǎn)酒精，通過(guò)在糖化階段和液化階段提高淀粉原料轉(zhuǎn)化為還原糖的效率并提高發(fā)酵料液中氮、磷等酵母菌生長(zhǎng)繁殖所必需的元素的含量，達(dá)到提高淀粉類(lèi)原料產(chǎn)酒率的目的，從而獲得一種提高玉米淀粉轉(zhuǎn)化率和利用率，有效控制生產(chǎn)成本，提高社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益的新型復(fù)合酶制劑，以期為整個(gè)酒精生產(chǎn)行業(yè)和淀粉類(lèi)原料產(chǎn)酒的復(fù)合酶制劑研究提供參考.

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料

市售玉米粉，其材料特性如表1.

表1 玉米原料特性表

1.1.2 菌種和酶制劑

菌種和酶制劑均為市場(chǎng)采購(gòu)，相關(guān)信息如表2.

表2 菌種和酶制劑

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用容量為1 L的玻璃罐作為發(fā)酵罐，方形水槽加水作為水浴保溫裝置，其間置200 W電加熱棒和循環(huán)水泵保持水溫均勻，另置溫度控制器以保持水浴溫度(如圖1).

圖1發(fā)酵裝置圖

Fig.1Fermentation device diagram

1.2.2 其他設(shè)備

電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；V-5000可見(jiàn)分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)生產(chǎn)；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；PHS-3C酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；電子萬(wàn)用爐，北京科偉永興儀器有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 傳統(tǒng)雙酶法酒精發(fā)酵試驗(yàn)

傳統(tǒng)雙酶法酒精發(fā)酵試驗(yàn)流程圖如圖2.

圖2 酒精發(fā)酵試驗(yàn)流程圖

取容量為1 L的發(fā)酵罐放置在不銹鋼水槽中，按1∶4的料水比配制待加熱的粉糊并均勻攪拌，浸泡6 h.然后加水蒸煮至糊化并升溫至90 ℃水浴加熱30 min，冷卻至60 ℃添加液化酶(添加量為0.1%)水浴并不斷攪拌.液化完畢后，在50 ℃時(shí)添加糖化酶(添加量為0.1%)進(jìn)行糖化，后冷卻至32 ℃加入已經(jīng)活化的酵母(添加量為0.5%)，然后放入長(zhǎng)方形水槽30 ℃恒溫水浴進(jìn)行酒精發(fā)酵.發(fā)酵結(jié)束后取200 mL發(fā)酵料液，加入50 mL蒸餾水然后進(jìn)行蒸餾，蒸餾出100 mL蒸餾液，用比重計(jì)法測(cè)定酒精度數(shù)換算并計(jì)算出酒率.

1.3.2 添加纖維素酶提高還原糖含量的單因素試驗(yàn)

玉米中的纖維素多存在于細(xì)胞壁中，不僅難以在玉米原料酒精發(fā)酵過(guò)程中被降解和利用，還會(huì)阻礙淀粉的釋放和利用.纖維素酶作用于玉米淀粉原料時(shí)，主要使難降解的纖維素分解成為還原糖，同時(shí)打破原料細(xì)胞壁的阻礙，協(xié)助提高淀粉向還原糖轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率，增加原料發(fā)酵料液中糖含量[8]，從而提高玉米淀粉的利用率和原料出酒率.

在傳統(tǒng)雙酶法的基礎(chǔ)上液化，液化完畢后降溫，然后在50 ℃時(shí)按0.1%的添加量添加糖化酶(添加量為0.1%)進(jìn)行糖化，待糖化結(jié)束后冷卻至40 ℃按設(shè)計(jì)添加量添加纖維素酶，在32 ℃加入酵母(添加量為0.5%)恒溫進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后取200 mL發(fā)酵料液，加入50 mL蒸餾水后蒸餾，蒸餾出100 mL蒸餾液，用比重計(jì)法測(cè)定酒精度數(shù)換算并計(jì)算出酒率.

1.3.3 添加果膠酶提高還原糖含量的單因素試驗(yàn)

果膠多糖是玉米原料細(xì)胞壁中的又一抗?fàn)I養(yǎng)因子，屬于非淀粉多糖，在液化和糖化過(guò)程中會(huì)增加發(fā)酵料液的黏度，阻礙液化酶和糖化酶與淀粉多糖充分接觸，從而降低原料的糖化率.果膠多糖在傳統(tǒng)雙酶法中不能被降解，通過(guò)添加果膠酶，可以降解發(fā)酵料液中的果膠多糖并使其轉(zhuǎn)化為還原糖為酵母利用，同時(shí)有利于打開(kāi)細(xì)胞壁，降低其對(duì)液化和糖化過(guò)程中酶降解淀粉時(shí)的阻礙作用，使發(fā)酵料液中的還原糖含量顯著上升，提高原料的出酒率.

在傳統(tǒng)雙酶法的基礎(chǔ)上液化，液化完畢后降溫，然后在50 ℃時(shí)按0.1%的添加量添加糖化酶(添加量為0.1%)進(jìn)行糖化，糖化結(jié)束后冷卻至40 ℃按設(shè)計(jì)添加量添加果膠酶，在32 ℃加入酵母(添加量為0.5%)恒溫進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后取200 mL發(fā)酵料液，加入50 mL蒸餾水后蒸餾，蒸餾出100 mL蒸餾液，用比重計(jì)法測(cè)定酒精度數(shù)換算并計(jì)算出酒率.

1.3.4 添加植酸酶提高出酒率的單因素試驗(yàn)

磷酸在酵母菌的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中扮演著重要角色，玉米原料中含有豐富的磷元素，但90%的磷元素都和肌醇結(jié)合成為植酸[9]，存于玉米的胚芽中，很難被酵母菌利用.植酸還能與發(fā)酵料液中諸多物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成螯合環(huán)，螯合能力強(qiáng)，降低發(fā)酵料液中蛋白質(zhì)和金屬離子的有效性，影響酵母菌的繁殖和生長(zhǎng).植酸酶可以分解植酸使其中的磷被釋放出來(lái)供酵母菌利用，加快酵母菌對(duì)還原糖的吸收和利用，有效提高發(fā)酵效率[10].通過(guò)添加植酸酶水解玉米中的植酸，還可以解除植酸對(duì)酵母菌利用原料中蛋白質(zhì)和其他礦物質(zhì)的阻礙，促進(jìn)發(fā)酵前期和發(fā)酵中期酵母菌的繁殖生長(zhǎng)和發(fā)育，提高酵母菌對(duì)還原糖的利用能力，提升發(fā)酵速率.

在傳統(tǒng)雙酶法基礎(chǔ)上進(jìn)行液化，然后在50 ℃時(shí)按0.1%的添加量添加糖化酶(添加量為0.1%)進(jìn)行糖化，待糖化結(jié)束后冷卻至40 ℃按設(shè)計(jì)添加量添加植酸酶，在32 ℃加入酵母(添加量為0.5%)恒溫進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后取200 mL發(fā)酵料液，加入50 mL蒸餾水后蒸餾，蒸餾出100 mL蒸餾液，用比重計(jì)法測(cè)定酒精度數(shù)換算并計(jì)算出酒率.

圖3 單因素試驗(yàn)流程圖

1.3.5 添加酸性蛋白酶提高出酒率的單因素試驗(yàn)

在傳統(tǒng)雙酶法基礎(chǔ)上液化，然后在50 ℃時(shí)按0.1%的添加量添加糖化酶(添加量為0.1%)糖化，待糖化結(jié)束后冷卻至40 ℃按設(shè)計(jì)添加量添加酸性蛋白酶，32 ℃加入酵母(添加量為0.5%)恒溫進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后取200 mL發(fā)酵料液，加入50 mL蒸餾水后蒸餾，蒸餾出100 mL蒸餾液，用比重計(jì)法測(cè)定酒精度數(shù)換算并計(jì)算出酒率.

1.3.6 正交試驗(yàn)

以前期進(jìn)行的單因素試驗(yàn)所得出結(jié)果作為設(shè)計(jì)依據(jù)，復(fù)合纖維素酶、果膠酶、植酸酶和酸性蛋白酶四種酶制劑，以他們的添加量作為影響因子設(shè)計(jì)開(kāi)展正交試驗(yàn)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表，響應(yīng)值為原料出酒率，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶制劑的配比，正交試驗(yàn)因子水平表如表3.

表3 正交試驗(yàn)因子水平表

1.4 測(cè)定項(xiàng)目和測(cè)定方法

酒精度:比重計(jì)法，采用酒精計(jì)法測(cè)定蒸餾出的酒的酒精度;

還原糖含量：DNS比色法(3,5-二硝基水楊酸比色法);

總糖含量:DNS比色法(3,5-二硝基水楊酸比色法);

纖維素含量：植物類(lèi)食品中粗纖維的測(cè)定(國(guó)標(biāo)法：GB/T 5009.10-2003);

速效磷含量:堿溶-鉬銻抗分光光度計(jì)法.

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.5 計(jì)算公式

還原糖含量(%)=

金融市場(chǎng)發(fā)展需要金融的科學(xué)監(jiān)管，才能保證其健康穩(wěn)定運(yùn)行。金融市場(chǎng)的變化多端為金融業(yè)的科學(xué)監(jiān)管提出了新的課題。在現(xiàn)代市場(chǎng)環(huán)境中，金融監(jiān)管制度與模式多種多樣，包括金融監(jiān)管理念與監(jiān)管思維的形成、金融監(jiān)管機(jī)構(gòu)的設(shè)立、各種金融監(jiān)管制度與政策的制定、金融措施和金融監(jiān)管行為的實(shí)施等。由于受到各種不斷變化經(jīng)濟(jì)環(huán)境的影響，常常導(dǎo)致金融監(jiān)管與金融市場(chǎng)之間的不匹配而使金融市場(chǎng)呈現(xiàn)順周期性，嚴(yán)重地阻礙著金融市場(chǎng)的健康發(fā)展。

總糖含量(%)=

原料出酒率(%)=

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：

線(xiàn)性回歸方程為y=1.0846x-0.0265,其中y是吸光度值(OD值)，x為葡萄糖含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同纖維素酶添加量對(duì)發(fā)酵料液還原糖含量的影響

纖維素酶在糖化結(jié)束后添加，開(kāi)展不同纖維素酶添加量的玉米原料酒精發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4.

表4纖維素酶不同添加量酒精發(fā)酵結(jié)果

Table 4Alcohol fermentation results with different amounts of cellulase

酶添加量/(U/g原料)還原糖/%殘還原糖/%出酒率/%028.173.1323.68428.893.0923.97829.832.8824.571230.172.7124.591630.192.6224.602030.192.6224.60

根據(jù)表4可以看出，當(dāng)添加的纖維素酶小于16 U/g原料時(shí)，隨著纖維素酶添加量的提高，還原糖含量逐漸提高而殘還原糖含量逐漸降低，玉米原料出酒率逐漸增加.當(dāng)纖維素酶的添加量為16 U/g原料，還原糖含量達(dá)到最大值30.19%，同時(shí)殘還原糖含量下降到最低值2.62%，玉米原料的出酒率達(dá)到最高值，為24.60%.當(dāng)纖維素酶添加量大于16 U/g原料后，發(fā)酵料液的還原糖含量、殘還原糖含量和玉米原料出酒率基本不變.試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米原料產(chǎn)酒試驗(yàn)中，纖維素酶的最適添加量為16 U/g原料.

2.2 不同果膠酶添加量對(duì)發(fā)酵料液糖含量的影響

果膠酶在糖化結(jié)束后添加，開(kāi)展不同果膠酶添加量的玉米原料酒精發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5.

根據(jù)表5可以看出，在果膠酶的添加量小于100 U/g原料之前，隨著果膠酶添加量的提高，還原糖含量逐漸提高而殘還原糖含量逐漸降低，玉米原料出酒率逐漸增加.當(dāng)果膠酶的添加量為100 U/g原料時(shí)，還原糖含量獲得最大值，為29.77%，同時(shí)殘還原糖含量下降到最低值2.88%，玉米淀粉的出酒率能夠達(dá)到24.83%，為最大值.在果膠酶添加量大于100 U/g原料之后，發(fā)酵料液的還原糖含量、殘還原糖含量和玉米原料出酒率基本不變.試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米原料產(chǎn)酒試驗(yàn)中，果膠酶的最適添加量為100 U/g原料.

2.3 不同植酸酶添加量對(duì)出酒率的影響

植酸酶在糖化結(jié)束后添加，開(kāi)展不同植酸酶添加量的玉米原料酒精發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6.

表5果膠酶不同添加量酒精發(fā)酵結(jié)果

Table 5Pectinase different addition amount of alcohol fermentation results

酶添加量/(U/g原料)還原糖/%殘還原糖/%出酒率/%028.174.0623.682528.513.6523.775028.903.0524.527529.522.8924.7910029.772.8824.8312529.772.8824.83

表6 植酸酶不同添加量酒精發(fā)酵結(jié)果

根據(jù)表6可以看出，當(dāng)添加的植酸酶小于9 U/g原料時(shí)，隨著植酸酶添加量的提高，還原糖含量逐漸提高而殘還原糖含量逐漸降低，玉米原料出酒率逐漸增加.當(dāng)植酸酶添加量為9 U/g原料時(shí)，有效磷含量和還原糖含量都上升到最高值，分別為3.15%和28.84%，同時(shí)殘還原糖含量下降到最低值2.24%，植酸酶的最適添加量為9 U/g原料.

2.4 不同酸性蛋白酶添加量對(duì)出酒率的影響

酸性蛋白酶在糖化結(jié)束后添加，開(kāi)展不同酸性蛋白酶添加量的玉米原料酒精發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7.

表7酸性蛋白酶不同添加量酒精發(fā)酵結(jié)果

Table 7Alcohol fermentation results of different amounts of acid protease

酶添加量/(U/g原料)殘還原糖/%殘總糖/%出酒率/%02.684.6523.6842.524.4024.1482.464.1824.74122.223.9224.90162.223.9424.90202.233.9224.89

根據(jù)表7可以看出，在酸性蛋白酶的添加量達(dá)到12 U/g原料之前，隨著酸性蛋白酶添加量的提高，殘還原糖含量和殘總糖均逐漸降低，玉米原料出酒率逐漸增加.當(dāng)酸性蛋白酶添加量達(dá)到12 U/g原料，殘還原糖含量和殘總糖含量均達(dá)到最低值，分別為2.23%和3.92%，同時(shí)玉米原料的出酒率達(dá)到最高為24.89%.在酸性蛋白酶添加量高于12 U/g原料后，發(fā)酵料液的殘還原糖含量和殘總糖含量和玉米原料出酒率基本不變.試驗(yàn)結(jié)果表明，酸性蛋白酶的最適添加量為12 U/g原料.

2.5 正交試驗(yàn)

表8為正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析，表9為方差分析.

表8 復(fù)合酶制劑正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

根據(jù)表8可以明顯看出，四種酶制劑A(纖維素酶)、B(果膠酶)、C(植酸酶)和D(酸性蛋白酶)對(duì)玉米原料產(chǎn)酒的影響程度依次為A>B>D>C,即纖維素酶>果膠酶>酸性蛋白酶>植酸酶，對(duì)于因素A、B、C和D對(duì)應(yīng)的最大均值分別為k2、k3、k2和k1，即復(fù)合酶制劑的最佳配比為A2B3C2D1，因此玉米原料產(chǎn)酒的復(fù)合酶制劑最優(yōu)配比應(yīng)為纖維素酶12 U/g原料、果膠酶125 U/g原料、植酸酶7 U/g原料和酸性蛋白酶8 U/g原料.以此優(yōu)化的復(fù)合酶制劑配比開(kāi)展3批次驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明玉米原料的出酒率提升至28.13%.

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表9可知，纖維素酶、果膠酶、植酸酶、酸性蛋白酶按照不同的配比添加到玉米原料產(chǎn)酒的試驗(yàn)中對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響性大小不一，其中纖維素酶和果膠酶對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響極其顯著，酸性蛋白酶則是有顯著影響.

3 結(jié)論和討論

單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果表明纖維素酶和果膠酶的最適添加量分別為16 U/g原料和100 U/g原料，而且添加纖維素酶和果膠酶能顯著提高發(fā)酵料液中還原糖的含量，這是由于原料中的纖維素和果膠多糖大部分構(gòu)成了植物細(xì)胞壁，添加了纖維素酶和果膠酶后，不僅促進(jìn)了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分解和淀粉的釋放利用，也使得纖維素和果膠多糖降解為可以被酵母利用的還原性糖，提高了原料的還原糖轉(zhuǎn)化率.

單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果表明植酸酶和酸性蛋白酶的最適添加量分別為9 U/g原料和12 U/g原料.在淀粉類(lèi)原料產(chǎn)酒發(fā)酵試驗(yàn)中添加植酸酶和酸性蛋白酶提供了酵母菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中必需的磷元素和氮元素，加快發(fā)酵速率，提高玉米淀粉利用率和產(chǎn)酒率.

正交試驗(yàn)考察了纖維素酶、果膠酶、植酸酶和酸性蛋白酶對(duì)玉米原料產(chǎn)酒發(fā)酵的影響，優(yōu)化后的復(fù)合酶制劑配比為纖維素酶12 U/g原料、果膠酶125 U/g原料、植酸酶7 U/g原料和酸性蛋白酶8 U/g原料.

復(fù)合酶制劑的優(yōu)化配比試驗(yàn)結(jié)果表明纖維素酶和果膠酶對(duì)原料出酒率有顯著影響，酸性蛋白酶對(duì)原料出酒率有影響.若實(shí)際應(yīng)用中考慮降低成本可以采用纖維素酶12 U/g原料、果膠酶125 U/g原料和酸性蛋白酶8 U/g原料的復(fù)合酶制劑配比.