載紫杉醇的pH敏感型熱休克蛋白納米載體的腫瘤細(xì)胞攝取特性及藥理學(xué)評(píng)估

楊惠卿，王 喻，駱紅飛，趙子明

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005；2.徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

藥物治療是惡性腫瘤治療的重要方法之一.傳統(tǒng)的抗腫瘤化療藥物靶向性差，毒副作用大，患者耐受性差，很大程度上制約了其臨床應(yīng)用[1-2]，而納米粒給藥系統(tǒng)由于其獨(dú)特的尺寸性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)，可將藥物靶向輸送到指定的腫瘤部位，提高局部藥物濃度，增強(qiáng)殺傷能力，所以在腫瘤治療領(lǐng)域中已成為國內(nèi)外研究者最關(guān)注的熱點(diǎn)之一[3-5].小分子熱休克蛋白(sHSP)具有球狀籠形空心結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部空腔可作為藥物的載庫[6]，且其內(nèi)、外表面都有豐富的可修飾位點(diǎn)[7]，因此可通過基因工程或化學(xué)手段進(jìn)行改造使其具有理想的性能與更多的功能[8-9].

通過前期研究自行設(shè)計(jì)并構(gòu)建了載紫杉醇(PTX)的pH敏感型HSP納米載體(PT-HSP).該載體以籠形蛋白HSP作為載藥內(nèi)核，穿膜肽Tat通過戊二醛接枝到HSP表面得T-HSP，最外層為對(duì)pH敏感的聚磺胺嘧啶/聚乙二醇丙烯酸共聚物(PSPA)通過靜電相互作用與T-HSP結(jié)合，制備得到Tat/PSPA修飾的PT-HSP[10].利用體內(nèi)腫瘤部位的pH比正常組織略低的生理特性[11-12]，可使PT-HSP在生理pH條件下包衣化而在腫瘤pH條件下去包衣化.通過這種pH敏感的轉(zhuǎn)變使Tat在正常組織被掩蓋而在腫瘤組織被暴露，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性.為進(jìn)一步闡明PT-HSP智能納米遞藥載體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的過程和作用，本研究將載PTX的PT-HSP分別與兩種腫瘤細(xì)胞共孵育，觀察藥物入胞情況，探究其影響因素及入胞機(jī)制，綜合評(píng)價(jià)其細(xì)胞殺傷能力，并分析其生物相容性，以期為靶向腫瘤細(xì)胞的納米給藥系統(tǒng)提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥品及試劑

聚乙二醇2000(PEG-2K,西隴化工公司),聚乙二醇4000(PEG-4K,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),聚乙二醇6000(PEG-6K,南京化學(xué)試劑公司),重組嗜熱古細(xì)菌(Methanococcusjannaschii)HSP、穿膜肽Tat(上海生工生物工程公司，純度>85%),PTX(西安昊軒生物科技公司，純度98.5%)，二甲基亞砜(DMSO,西隴化工公司)，異硫氰基熒光素(FITC，上海阿拉丁試劑公司)，樹脂天青(上海阿拉丁試劑公司，純度≥90%)，秋水仙堿(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，制霉菌素(美國BIOSHARP公司)，鹽酸氯丙嗪(CPZ，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，莫能星鈉(上海源葉生物科技公司)，疊氮化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，臺(tái)盼藍(lán)(K940，南京凱基生物科技公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)，RIPA裂解液(南京凱基生物科技公司)，胎牛血清(特級(jí)，浙江天杭生物科技股份有限公司).

1.1.2 儀 器

F4500熒光分光光度計(jì)、UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)(日本日立公司),冷凍干燥機(jī)(FD-1C-50，日本島津公司),低速離心機(jī)(5702，北京博醫(yī)實(shí)驗(yàn)儀器公司),倒置顯微鏡(CKX31，德國Eppendorf公司),倒置熒光顯微鏡(U-REL-T、TH4-200、TX2-ILL100，日本奧林巴斯公司).

1.1.3 細(xì)胞株、培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

倉鼠肺成纖維細(xì)胞CHL、人肺癌細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞HeLa(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，DMEM(高糖)培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基(南京凱基生物科技公司)，普通級(jí)兔(徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心).

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

CHL和HeLa細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基，A549細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基,均含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清并添加1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗(80 U/mL青霉素和0.08 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 細(xì)胞攝取影響因素實(shí)驗(yàn)

稱取4.0 mg Tat溶于5 mL DMSO中，按摩爾比1∶2加入1.6 mg FITC，37 ℃下攪拌反應(yīng)12 h，將混合液裝入透析袋并置于去離子水中透析，4 h更換一次透析液，透析24 h.透析液經(jīng)凝膠滲透層析柱(Sephadex G50，美國Pharmacia公司)分離游離的FITC，收集FITC標(biāo)記的Tat(即FITC-Tat)，進(jìn)一步制得FITC標(biāo)記的T-HSP與PT-HSP[10].

取對(duì)數(shù)生長期的CHL細(xì)胞以1×105/孔置于24孔板培養(yǎng)24 h.棄去原有培養(yǎng)基，更換為pH 7.4的無血清DMEM培養(yǎng)基.分別選擇PEG-2K、PEG-4K和PEG-6K制備的PT-HSP，向每孔中加入200 μg/mL按上述方法制備所得FITC標(biāo)記的T-HSP與PT-HSP，37 ℃，100 r/min共孵育4 h.用倒置熒光顯微鏡拍攝其入胞情況.用RIPA裂解液裂解細(xì)胞20 min，3 000 r/min下室溫離心10 min，取上清用熒光分光光度計(jì)檢測FITC的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長450 nm，發(fā)射波長520 nm，狹縫寬度5 nm)，以T-HSP為對(duì)照，分析不同相對(duì)分子質(zhì)量的PSPA對(duì)細(xì)胞攝取的影響.

參照上述步驟，采用PEG-6K制備的PSPA,按n(HSP亞基)∶n(PSPA)=1∶1，1∶2，1∶3(下文稱投料比)分別制備PT-HSP.以T-HSP為對(duì)照，分析不同投料比對(duì)細(xì)胞攝取的影響.

1.2.3 體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的CHL、A549和HeLa細(xì)胞，以1×105/孔置于24孔板培養(yǎng)24 h.棄去原有培養(yǎng)基，CHL細(xì)胞更換為pH 7.4的無血清DMEM培養(yǎng)基，A549和HeLa細(xì)胞更換為pH 6.5的無血清培養(yǎng)基.然后向每孔中加入200 μg/mL FITC標(biāo)記的T-HSP與PT-HSP，37 ℃、100 r/min共孵育4 h.倒置熒光顯微鏡下拍攝其入胞情況.

1.2.4 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的CHL細(xì)胞，以1×105/孔置于24孔板培養(yǎng)24 h.棄去原有培養(yǎng)基，更換為pH 7.4(生理pH條件)的無血清DMEM培養(yǎng)基.按50和25 μg/mL的PTX實(shí)際質(zhì)量濃度，分別將PTX的DMSO溶液、載PTX的T-HSP及載PTX的PT-HSP加入培養(yǎng)孔中，每個(gè)濃度3個(gè)平行孔，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h.

取對(duì)數(shù)生長期的HeLa和A549細(xì)胞，以5×104/孔置于96孔板培養(yǎng)24 h.棄去原有培養(yǎng)基，更換為pH 6.5(腫瘤pH條件)的無血清培養(yǎng)基.按0.5，1.0，2.0，5.0，10，15，25，50 μg/mL的PTX實(shí)際質(zhì)量濃度，分別將PTX的DMSO溶液和載PTX的T-HSP加入培養(yǎng)孔中，每個(gè)濃度3個(gè)平行孔，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h.

培養(yǎng)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，24和96孔板各孔分別加入200和100 μL胰酶消化細(xì)胞.待細(xì)胞完全懸浮后加200和100 μL培養(yǎng)基終止消化，吸取各孔液體，置于1.5 mL離心管中1 500 r/min離心3 min，棄去上清液，加入400和200 μL 0.04%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))臺(tái)盼藍(lán)溶液，小心混勻，取10 μL用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù).以不給藥組的細(xì)胞數(shù)為對(duì)照，計(jì)算各給藥組的細(xì)胞存活率.

1.2.5 生物安全性評(píng)價(jià)

1) 細(xì)胞毒性檢測

按1.2.4小節(jié)中的方法取CHL細(xì)胞并更換培養(yǎng)基，分別將HSP、T-HSP及PT-HSP按1 500，750，325，160，80，40 μg/mL的質(zhì)量濃度加入培養(yǎng)孔中，每個(gè)濃度3個(gè)平行孔.加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3遍后，按100 μg/mL加入樹脂天青溶液[13]，繼續(xù)培養(yǎng)2 h.然后將培養(yǎng)液稀釋100倍后用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度，以不加載體組的熒光強(qiáng)度為對(duì)照，計(jì)算不同載體組在各濃度下的細(xì)胞存活率.

2) 溶血試驗(yàn)

抽取普通級(jí)兔新鮮血液15 mL，加入適量肝素，1 500 r/min離心5 min收集紅細(xì)胞.用PBS清洗3遍后棄去上清，配制成2.5%(體積分?jǐn)?shù))的紅細(xì)胞懸液.分別配制20 mg/mL T-HSP和PT-HSP納米混懸液，各取0.1，0.2，0.4 mL，用PBS定容至2 mL.另取2 mL PBS和去離子水，分別加入2 mL紅細(xì)胞懸液，充分混勻，其中PBS組作為陰性對(duì)照組，去離子水組作為陽性對(duì)照組.在37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中孵育 1 h，3 000 r/min離心10 min，分別用T-HSP與PT-HSP混懸液作為空白對(duì)照，在541 nm處測定上清的吸光度，計(jì)算溶血率(hemolysis ratio，RH)：

RH=(A樣品-A陰性對(duì)照)/(A陽性對(duì)照-A陰性對(duì)照)×100%.

1.2.6 細(xì)胞攝取機(jī)制分析

取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，以1×105/孔置于24孔板培養(yǎng)24 h.棄去原有培養(yǎng)基，更換為pH 6.5的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基.分別加入不同的細(xì)胞攝取抑制劑CPZ(10 μg/mL)、秋水仙堿(50 μg/mL)、疊氮化鈉(1 mg/mL)、制霉菌素(6 μg/mL)及莫能星鈉(2 μg/mL)，37 ℃、100 r/min共孵育30 min.再向每孔中加入200 μg/mL FITC標(biāo)記的PT-HSP，37 ℃、100 r/min繼續(xù)孵育2 h.用RIPA裂解液裂解細(xì)胞20 min，3 000 r/min離心10 min，取上清用熒光分光光度計(jì)檢測FITC的熒光強(qiáng)度，以不加抑制劑的單純載體組為對(duì)照，比較各抑制劑的作用強(qiáng)度，分析PT-HSP的入胞機(jī)制.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異中等顯著，p<0.001 表示差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞攝取的影響因素

2.1.1 不同相對(duì)分子質(zhì)量的PSPA

如圖1所示：PEG-2K和PEG-4K組的入胞情況較好，而PEG-6K組熒光在胞內(nèi)分布明顯減少，且與PEG-2K、PEG-4K組的細(xì)胞攝取率有極顯著差異，表明只有具有長鏈PEG的PSPA包衣層才可以顯著抑制CHL細(xì)胞對(duì)PT-HSP的攝取.

(a) 顯微觀察結(jié)果;(b) 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：*，* *，* * *分別

圖1 PSPA相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)PT-HSP入胞的影響

Fig.1 Effects of the relative molecular masses of PSPA on PT-HSP enterance into cells

2.1.2 不同投料比

如圖2所示:PT-HSP的入胞情況與T-HSP相比，投料比為1∶1時(shí)無顯著差異，而投料比為1∶2和1∶3時(shí)細(xì)胞攝取率均有極顯著減小，表明其抑制入胞作用顯著強(qiáng)于投料比為1∶1時(shí).

* * *表示與T-HSP組比較，p<0.001.圖2 HSP亞基與PSPA投料比對(duì)PT-HSP入胞的影響Fig.2 Effects of the ratios of HSP subunit to PSPA on PT-HSP entrance into cells

細(xì)胞攝取影響因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)投料比超過1∶2且PEG相對(duì)分子質(zhì)量較大(6 000)時(shí)，PSPA包衣可完全掩蓋Tat，對(duì)PT-HSP進(jìn)入正常細(xì)胞有明顯抑制作用.故后續(xù)均采用投料比1∶2且PEG相對(duì)分子質(zhì)量為6 000的PT-HSP進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2.2 不同細(xì)胞的體外攝取差異

為探究正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞對(duì)PT-HSP的攝取情況，將T-HSP和PT-HSP分別與CHL、A549和HeLa細(xì)胞共培養(yǎng).從圖3可見：T-HSP在生理pH條件下培養(yǎng)的CHL細(xì)胞中有一定的分布，而PT-HSP基本不入胞.T-HSP可被腫瘤pH條件下培養(yǎng)的A549和HeLa細(xì)胞大量攝取，而PT-HSP在同樣條件下也可被細(xì)胞攝取，且熒光強(qiáng)度與攝取T-HSP的細(xì)胞相比未見減弱.上述結(jié)果表明PT-HSP能被A549和HeLa兩種腫瘤細(xì)胞大量攝取，而被正常CHL細(xì)胞攝取得極少，體現(xiàn)出良好的體外腫瘤細(xì)胞靶向性.

圖3 T-HSP和PT-HSP被正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞攝取的情況Fig.3 Uptake of T-HSP and PT-HSP by normal and tumor cells

2.3 細(xì)胞殺傷的選擇性

為確認(rèn)載PTX的PT-HSP對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞具有高選擇性殺傷能力，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行驗(yàn)證.如圖4(a)所示，在CHL細(xì)胞中，載PTX的PT-HSP組細(xì)胞存活率極顯著高于PTX注射液組和載PTX的T-HSP組.由于PT-HSP在腫瘤pH條件下會(huì)去包衣化暴露Tat，所以只分析載PTX的T-HSP在相同PTX濃度下對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用.如圖4(b)和(c)所示，在A549和HeLa細(xì)胞中載PTX的T-HSP組細(xì)胞存活率均顯著低于PTX注射液組.可見載PTX的T-HSP對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞均有較強(qiáng)殺傷作用；而載PTX的PT-HSP對(duì)正常細(xì)胞傷害較小，對(duì)腫瘤細(xì)胞則具有較強(qiáng)殺傷作用，說明經(jīng)PSPA包衣化的載PTX的PT-HSP能更好地選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞.

圖4 PTX與載PTX的納米載體對(duì)CHL(a)、A549(b)和HeLa(c)細(xì)胞的殺傷作用Fig.4 Cell killing effects of PTX and PTX-loaded nano-carriers on CHL (a),A549 (b) and Hela (c) cells

2.4 生物安全性分析

2.4.1 細(xì)胞毒性

如圖5所示，在40～750 μg/mL的質(zhì)量濃度下，不同載體對(duì)細(xì)胞活性均無顯著影響，僅當(dāng)T-HSP的質(zhì)量濃度高達(dá)1 500 μg/mL(遠(yuǎn)超其使用濃度)時(shí)才對(duì)CHL細(xì)胞產(chǎn)生顯著影響，而HSP與PT-HSP在高濃度時(shí)仍對(duì)CHL細(xì)胞活性無顯著影響，表明這三者在正常使用時(shí)對(duì)CHL細(xì)胞均不會(huì)產(chǎn)生毒性，其中PT-HSP的安全性優(yōu)于T-HSP.

圖5 HSP、T-HSP、PT-HSP對(duì)CHL細(xì)胞的毒性Fig.5 Cytotoxicity of HSP,T-HSP,PT-HSP to CHL cells

2.4.2 體外溶血率

如圖6所示，分析載體質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0和2.0 mg/mL時(shí)的體外溶血率，T-HSP分別為(1.2±0.7)%，(2.6±0.5)%和(4.9±0.8)%，PT-HSP分別為(0.7±0.2)%，(1.2±0.4)%和(1.6±0.5)%，可見體外注射PT-HSP的溶血率低于5%，不會(huì)引起溶血[14]，表明PT-HSP具有良好的生物安全性.

* *表示與T-HSP組比較，p<0.05.圖6 T-HSP和PT-HSP的溶血試驗(yàn)Fig.6 Hemolysis assay of T-HSP and PT-HSP

2.5 細(xì)胞攝取機(jī)制

細(xì)胞內(nèi)吞主要有網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、巨胞飲以及網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴的內(nèi)吞4種機(jī)制[15].為分析PT-HSP進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞方式，選用5種不同的抑制劑：疊氮化鈉抑制ATP酶，CPZ封閉網(wǎng)格蛋白有被小泡，莫能星鈉阻斷網(wǎng)格蛋白受體的循環(huán)利用，制霉菌素抑制小窩蛋白，秋水仙堿抑制微管蛋白從而阻斷細(xì)胞的巨胞飲作用.各抑制劑的加入對(duì)PT-HSP入胞情況的影響如圖7所示：疊氮化鈉具有最強(qiáng)的抑制作用，細(xì)胞攝取率僅為(2.4±0.5)%;其次為秋水仙堿和制霉菌素，細(xì)胞攝取率分別為(35.1±8.7)%和(50.4±1.4)%;而CPZ和莫能星鈉的抑制作用不顯著.

* * *表示與未加抑制劑的單純載體組比較，p<0.001.圖7 細(xì)胞攝取抑制劑對(duì)PT-HSP入胞的影響Fig.7 Effects of inhibitors of cellular uptake on PT-HSP enterance into cells

上述結(jié)果表明PT-HSP主要通過依賴能量的巨胞飲方式和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入A549細(xì)胞，可見Tat在PT-HSP的入胞過程中起主導(dǎo)作用.

3 結(jié) 論

本研究基于前期構(gòu)建的PT-HSP，對(duì)其在腫瘤細(xì)胞中的攝取特性、藥理學(xué)活性和細(xì)胞攝取機(jī)制進(jìn)行探究.結(jié)果表明載PTX的PT-HSP體外腫瘤靶向性能較好，相比于PTX和載PTX的T-HSP能更好地選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的傷害，且生物安全性良好.綜上所述，PT-HSP作為一種新型腫瘤藥物靶向遞送載體，既實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)抗腫瘤藥的效果，又減少了其毒副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景.