紅花根際溶磷菌的篩選與培養(yǎng)條件優(yōu)化

劉玉鳳　馬麗娟　張婷婷　馬磊

摘要：土壤中的溶磷菌可增加難溶性磷酸鹽的溶解性，提高植物對磷的吸收和利用。利用溶磷圈法，從紅花根際土壤中，初步篩選出具有較高溶磷能力的菌株RC01，并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖為碳源、（NH4）2SO4為氮源，在30 ℃、0.3 g/L NaCl條件下，該菌的溶磷效果較好;正交試驗(yàn)結(jié)果表明，10 g/L葡萄糖、0.5 g/L （NH4）2SO4、30 ℃、0.35 g/L NaCl時，溶磷量最大。RC01經(jīng)過16S rRNA測序鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas），其良好的溶磷菌特性，可為促進(jìn)紅花生長的相關(guān)微生物研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紅花;根際;溶磷菌;分離;篩選;培養(yǎng)條件;優(yōu)化

中圖分類號：S182?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0287-04

收稿日期：2018-06-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31560310，31760302）。

作者簡介：劉玉鳳（1993—），女，新疆石河子人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镄畔W(xué)。E-mail：1029454784@qq.com。

通信作者：馬?磊，博士，副教授，研究方向?yàn)樯镄畔W(xué)與分子遺傳學(xué)，E-mail：malei1979@hotmail.com;張婷婷，碩士，講師，研究方向?yàn)榉肿舆z傳學(xué)，E-mail：zting@shzu.edu.cn。

磷元素是植物生命活動所必需元素之一。植物吸收利用的磷元素主要源于土壤，而我國約有74%的耕地土壤缺磷，且土壤中95%的磷的存在形式難以被植物吸收[1]。然而，土壤中溶磷菌可將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可吸收磷酸鹽，提高植物對磷肥的利用率，增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，減少土壤對磷酸鹽的吸附性，避免過施磷肥環(huán)境污染[2]。溶磷菌廣泛分布在根際、土壤及種子表面[3]。分離和利用土壤溶磷微生物，促進(jìn)植物吸收磷元素，已成為生物肥料研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，對于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重大的意義。

紅花（Carthamus tinctorius L.）是一種集藥材、油料、燃料、飼料為一體的特種經(jīng)濟(jì)作物[4]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的意義。目前，國內(nèi)外有關(guān)植物根際溶磷菌的研究較多，已涉及玉米[5]、春小麥、苜蓿[6]、大豆[7]等多種植物，但關(guān)于紅花根際溶磷菌的研究報道較少[8]。本試驗(yàn)從紅花根際篩選出了溶磷菌株，并對其溶磷能力進(jìn)行研究，為研發(fā)促進(jìn)紅花生長的生物菌肥的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?樣品采集

供試土壤采自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)場，在紅花開花期選擇無病蟲害、長勢良好的植株，根際土壤采集采取“抖根法”[9]進(jìn)行，記錄采集時間、地點(diǎn)、土壤性質(zhì)和類型，各樣品按常規(guī)方法分別混合后裝入滅菌信封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基為蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。

蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基（每1 000 mL）：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，磷礦粉10 g，酵母膏0.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.5。

蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基：在蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%～2.0%的瓊脂制成蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

將馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊后稱取200 g，加水煮爛（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），然后用紗布過濾，將馬鈴薯汁濾出待用。如需制成固體培養(yǎng)基，可向其中加入1.5%～2.0%的瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后，再補(bǔ)足水分至1 000 mL，分裝試管或者錐形瓶，密封，高壓滅菌（121 ℃、101 kPa），20 min后保藏待用。

1.3?溶磷菌的分離與純化

溶磷菌的培養(yǎng)與收集：稱取10 g根際土壤置于盛有90 mL 無菌水的三角瓶中，振蕩15 min（160 r/min）使土樣均勻分散在無菌水中成為土壤懸液，用加樣器吸取1 mL土壤懸液至盛有9 mL無菌水中的試管中，吹吸3次使之充分混勻，依次配備濃度為10-3、10-4、10-5、10-6，再從10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液中取0.1 mL溶液，均勻涂布于蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上。每個濃度重復(fù)3組，于20～30 min后倒置，并放于28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)。

溶磷菌株初選：觀察溶磷圈，將蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基制成平板、分區(qū)，每區(qū)點(diǎn)植1個菌株，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察有無溶磷圈生成，測定溶磷圈直徑（D，cm）、菌落直徑（d，cm），根據(jù)能否產(chǎn)生溶磷圈初步判斷菌株有無溶磷能力，根據(jù)D/d大小初步確定菌株的溶磷能力的大小。

搖瓶復(fù)選及定量測定：于150 mL三角瓶中盛入蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基50 mL，高壓滅菌20 min（121 ℃、101 kPa）備用。分別接種每株溶磷菌的孢子懸液1 mL于滅菌的液體培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，每個處理3次重復(fù)，搖床培養(yǎng)（30 ℃、160 r/min）7 d，4 ℃條件下離心，取適量的上清液，采用鉬銻抗比色法測定其磷含量[10]，并用酸度計測定其pH值。

1.4?培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)，分別改變培養(yǎng)基中碳源種類、氮源種類、溫度、NaCl濃度，測量培養(yǎng)液中磷的含量，以確定較適宜的培養(yǎng)基組成。

碳源的篩選：選取溶磷效果最好的菌株進(jìn)行碳源篩選試驗(yàn)。分別采用10 g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖取代蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的碳源，其余培養(yǎng)條件不變，通過試驗(yàn)比較得出較適宜的碳源。

氮源的篩選：分別選取0.5 g/L（NH4）2SO4、KNO3、NH4NO3、尿素取代蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的氮源，碳源采用已試驗(yàn)得出的較適宜的碳源，其余培養(yǎng)條件不變，得出較適宜的氮源。

溫度的選擇：在PDA液體培養(yǎng)基中將待測菌株活化24 h后，按照1%的接種量接種于蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，于各溫度梯度（20、25、30、35、40 ℃）、160 r/min的條件下培養(yǎng)7 d，測定培養(yǎng)液中磷的含量，得出最適培養(yǎng)溫度。

NaCl濃度的選擇：于150 mL三角瓶中分別盛入按不同NaCl濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）配置的蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基各50 mL并接入菌株，其他培養(yǎng)條件不變，得出較適宜的NaCl濃度。

1.5?正交試驗(yàn)

確定菌株生長的最適培養(yǎng)條件為碳源為葡萄糖，氮源為（NH4）2SO4后，以葡萄糖的濃度、（NH4）2SO4的濃度、溫度、NaCl濃度為4個變化因素，每個因素取3個水平，采用L9（34）正交表2進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)，供試因素及水平見表1，每組處理2個重復(fù)。在PDA液體培養(yǎng)基中將待測菌株活化24 h后，按照1%的接種量接種于各培養(yǎng)基中，于各溫度、160 r/min的條件下培養(yǎng)7 d，測定培養(yǎng)液中磷的含量。

提取菌體DNA，采用16S rRNA（16S ribosomal RNA）通用引物8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1 492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min;然后94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rRNA測序，對測得序列在NCBI進(jìn)行在線比對，下載相似性最高的已知菌序列，用Clustal X軟件包程序?qū)π蛄羞M(jìn)行序列比對，再通過MEGA 5.05軟件對所有序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行遺傳鑒定。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株篩選

從蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基中篩選出3株菌，將其命名為RC01（菌落直徑d=0.3 cm、溶磷圈直徑D=0.4 cm）、45-3（d=0.2 cm、D=0.25 cm）、45-4（d=0.1 cm、D=0.13 cm），將具有溶磷能力的菌種RC01、45-3、45-4挑出，進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)和純化，淘汰掉失去溶磷能力的菌株45-4和溶磷能力比較差的菌株45-3，保存溶磷能力較強(qiáng)的的菌種RC01。RC01菌株在培養(yǎng)基上的溶磷圈如圖1所示，菌株周圍出現(xiàn)明顯的透明圈，菌株呈淡黃色。

2.2?定量測定溶磷菌RC01的溶磷能力

以空白試驗(yàn)溶液為參照，用鉬銻抗比色法定量測定溶磷菌RC01在720 nm波長的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）

在蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中接種供試菌株RC01，24 h后開始測定菌液中的可溶性磷含量及菌液的pH值，然后每隔24 h測1次，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著接種時間的延長，菌株的溶磷量不斷增加，120 h時菌株的溶磷量達(dá)到最大值，隨后溶磷量開始下降，培養(yǎng)液的pH值隨接種時間先不斷降低，在120 h時pH值最低，隨后逐漸回升至中性，結(jié)合溶磷菌的溶磷機(jī)制分析出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因，可能是溶磷菌RC01在生長過程中分泌了有機(jī)酸，酸性物質(zhì)促進(jìn)難溶性的磷礦粉釋放出磷離子，在120 h 時溶磷量達(dá)到最大值（514.37 μg/mL），pH值達(dá)到最小值（5.2），說明溶磷菌RC01在培養(yǎng)120 h時的溶磷效果最好。

2.3?對溶磷菌RC01培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1?單因素試驗(yàn)

2.3.1.1?碳源的篩選

分別選取葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖作為碳源對溶磷菌RC01進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，不同碳源對溶磷菌RC01的影響如圖4所示。

由圖4可知，不同碳源對溶磷菌RC01溶磷量的影響由大到小為葡萄糖>蔗糖>可溶性淀粉>麥芽糖。碳源由葡萄糖提供時，溶磷菌RC01的溶磷量達(dá)到最大（501.32 μg/mL）;碳源由麥芽糖提供時，溶磷量最?。?1.73 μg/mL）。這個結(jié)果說明溶磷菌RC01對葡萄糖的利用率最大，其次依次是蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖，其中對麥芽糖的利用率最低。

2.3.1.2?氮源的篩選

分別選?。∟H4）2SO4、KNO3、NH4NO3、尿素作為氮源對溶磷菌RC01進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，不同氮源對溶磷菌RC01的影響如圖5所示。

由圖5可知，不同氮源對溶磷菌RC01的溶磷量的影響由大到小為（NH4）2SO4>尿素>KNO3>NH4NO3，氮源由（NH4）2SO4提供時，溶磷菌RC01的溶磷量達(dá)到最大（475.36 μg/mL），氮源由NH4NO3提供時，溶磷量最?。?3.80 μg/mL），說明溶磷菌RC01對（NH4）2SO4的利用率最大，其次依次是尿素、KNO3、NH4NO3，其中對NH4NO3的利用率最低。

2.3.1.3?溫度的選擇

在不同的溫度（20、25、30、35、40 ℃）條件下，對溶磷菌RC01進(jìn)行溫度篩選試驗(yàn)，不同溫度對溶磷菌RC01溶磷效果的影響如圖6所示。

由圖6可知，隨著溫度的增高，溶磷菌RC01的溶磷量先是不斷升高，當(dāng)溫度為30 ℃時，溶磷菌RC01的溶磷量最大，隨后溶磷量不斷降低。