Sf9昆蟲細(xì)胞系的致瘤性研究

胡波 王芳 范志宇 宋艷華 魏后軍 薛家賓 姜平

摘要：為確定Sf9昆蟲細(xì)胞系作為疫苗生產(chǎn)細(xì)胞株的安全性，檢測了Sf9細(xì)胞對裸鼠的致瘤性。將3周齡SPF級雌性裸鼠隨機(jī)分為5組，分別為Sf9基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組、Sf9最高限制代次細(xì)胞組、陽性對照Hep-2細(xì)胞組、陰性對照CEF細(xì)胞組和空白對照組，以各自細(xì)胞懸液皮下接種裸鼠。在接種后21 d和84 d觀察接種部位腫瘤形成情況，并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果顯示，接種后21 d，Hep-2細(xì)胞組裸鼠注射部位形成米粒大小結(jié)節(jié)，經(jīng)病理組織學(xué)檢查為鱗狀細(xì)胞癌，而CEF細(xì)胞組和Sf9細(xì)胞組注射部位均無結(jié)節(jié)。接種后84 d，經(jīng)病理組織學(xué)檢查，CEF細(xì)胞組和Sf9細(xì)胞組均無腫瘤形成。本研究表明基礎(chǔ)代次和最高限制代次Sf9細(xì)胞均不具有致瘤性，Sf9細(xì)胞可用于疫苗生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：Sf9細(xì)胞;致瘤性;裸鼠;疫苗;安全性

中圖分類號： S852.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0209-03

收稿日期：2018-06-15

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（編號：CARS-43-C-1）。

作者簡介：胡?波（1982—），男，江蘇南京人，博士，副研究員，主要從事畜禽疫病防控與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。Tel：（025）84390337;E-mail：hubolshg@163.com。

通信作者：姜?平，博士，教授，主要從事動物傳染病學(xué)研究。Tel：（025）84396640;E-mail：jiangp@njau.edu.cn。

昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）屬于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，廣泛用于制備重組蛋白和病毒樣顆粒以進(jìn)行基礎(chǔ)生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究，據(jù)報道已成功用于數(shù)百種外源蛋白的表達(dá)[1]。目前，該系統(tǒng)研究較多的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（AcNPV），其宿主是草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞（Sf9細(xì)胞）。

利用BEVS系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)在Sf9細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白，所表達(dá)的外源蛋白幾乎均為可溶性蛋白，其生物學(xué)活性接近天然來源的分離物，因此可利用BEVS生產(chǎn)各種動物疾病的免疫疫苗或治療藥物。目前，國內(nèi)動物疫苗研究中，已有豬流行性腹瀉病毒[2]、偽狂犬病病毒[3]、豬圓環(huán)病毒[4-5]、禽流感病毒[6]、新城疫病毒[7-8]、兔出血癥病毒[9]等數(shù)十種動物病毒的抗原蛋白在Sf9細(xì)胞中表達(dá)。據(jù)我國獸用生物制品相關(guān)規(guī)定，作為動物疫苗生產(chǎn)的Sf9細(xì)胞株，需對該細(xì)胞進(jìn)行致瘤性檢驗以確保疫苗的安全性[10]。本研究取不同代次的Sf9昆蟲細(xì)胞，采用裸鼠體內(nèi)接種法檢測其致瘤性，為Sf9昆蟲細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)細(xì)胞株的安全性提供試驗依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?細(xì)胞與培養(yǎng)基

Sf9昆蟲細(xì)胞來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），由筆者所在實(shí)驗室傳代并保存;Hep-2細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;CEF原代細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗室分離培養(yǎng);Sf-900TMⅡSFM培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司。

1.2?實(shí)驗動物

3周齡SPF雌性裸鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所，飼養(yǎng)于實(shí)驗動物中心屏障系統(tǒng)隔離器中嚴(yán)格無菌飼養(yǎng)。

1.3?細(xì)胞傳代及細(xì)胞庫的建立

將筆者所在實(shí)驗室保存的Sf9細(xì)胞作為原始種子1代，按細(xì)胞傳代方法以“1傳3，2 d傳1代”方式，于27～28 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)傳代培養(yǎng)至60代，建立Sf9細(xì)胞原始細(xì)胞庫（第5代）、基礎(chǔ)細(xì)胞庫（第10代）、工作細(xì)胞庫（第15代），并規(guī)定最高限制代次細(xì)胞為60代。

1.4?細(xì)胞接種

將3周齡SPF級雌性裸鼠50只隨機(jī)分為5組，分別設(shè)為Sf9基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組、Sf9最高限制代次細(xì)胞組、陽性對照Hep-2細(xì)胞組、陰性對照CEF細(xì)胞組和不作任何處理的空白對照組，每組10只。基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組裸鼠每只皮下注射1×107個/0.2 mL第10代Sf9細(xì)胞懸液，最高限制代次細(xì)胞組裸鼠每只皮下注射1×107個/0.2 mL第60代Sf9細(xì)胞懸液，陽性對照組裸鼠每只皮下注射1×106個/0.2 mL Hep-2細(xì)胞懸液，陰性對照組裸鼠每只皮下注射1×106個/0.2 mL CEF細(xì)胞懸液。

1.5?腫瘤觀察及判定

各細(xì)胞試驗組連續(xù)觀察14 d，檢查接種部位皮下是否有腫瘤形成。如有結(jié)節(jié)或可疑病灶，繼續(xù)觀察7 d，取病變部位組織，采用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)裸鼠，分別于注射后21 d和84 d，各取一半裸鼠脫頸椎處死，對接種部位進(jìn)行解剖檢查，觀察各淋巴結(jié)和各器官中有無結(jié)節(jié)形成，如果可疑進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

2?結(jié)果與分析

2.1?Sf9細(xì)胞顯微鏡觀察

對第5、10、15、60代Sf9細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察拍照，由圖1可知，各代次細(xì)胞的形態(tài)較為一致，呈圓形、晶瑩透亮、大小均一，直徑約為15 μm。

2.2?裸鼠外部及解剖觀察

各代次細(xì)胞接種裸鼠后，在試驗觀察期內(nèi)各組動物均健康存活。在接種后14 d，陽性對照Hep-2細(xì)胞組裸鼠經(jīng)外部觀察，發(fā)現(xiàn)注射部位有粟米大小的結(jié)節(jié)（腫塊）形成，至21 d 結(jié)節(jié)變大（圖2-A），經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)注射部位有米粒大結(jié)節(jié)（圖2-F），各淋巴結(jié)、器官均正常，未見結(jié)節(jié)形成;而陰性對照（CEF細(xì)胞組、Sf9基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組和Sf9最高限制代次細(xì)胞組）注射部位未見有結(jié)節(jié)形成;在接種后84 d，與空白對照組（圖2-E、圖2-J）和陰性對照CEF細(xì)胞組（圖2-B、圖2-G）相比，Sf9基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組（圖2-C、圖2-H）和Sf9最高限制代次細(xì)胞組裸鼠（圖2-D、圖2-I）經(jīng)外部觀察，注射部位未見有結(jié)節(jié)形成，解剖后，注射部位未見有結(jié)節(jié)，各淋巴結(jié)、各內(nèi)臟器官正常，未見有結(jié)節(jié)形成。

2.3?病理組織學(xué)檢查

陽性對照Hep-2細(xì)胞組裸鼠，在接種細(xì)胞21 d后進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)注射部位有米粒大結(jié)節(jié)。取注射部位病變組織，采用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下做病理組織學(xué)檢查。結(jié)果顯示，病變部位組織內(nèi)為鱗狀細(xì)胞癌（圖3-A），陽性對照組接種腫瘤形成率為100%;在接種后84 d，與空白對照組和陰性對照CEF細(xì)胞組相比，Sf9基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組和Sf9最高限制代次細(xì)胞組經(jīng)解剖后，注射部位未見有結(jié)節(jié)，各淋巴結(jié)、各內(nèi)臟器官均正常，未見有結(jié)節(jié)形成，隨機(jī)選取Sf9基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組和Sf9最高限制代次細(xì)胞組裸鼠肝臟、脾臟做病理組織學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)有瘤細(xì)胞（圖3-B、圖3-C和圖3-D、圖3-E）。

3?討論與結(jié)論

鑒于昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）可獲得大量免疫原性好、與天然蛋白功能相似的可溶性重組蛋白，已被用于蛋白質(zhì)表達(dá)、疫苗生產(chǎn)和病毒制備等各方面[11]。重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞后可對外源蛋白進(jìn)行許多真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工作用，包括蛋白質(zhì)折疊及糖基化、磷酸化、?；?。同時，相比于哺乳動物細(xì)胞，Sf9細(xì)胞為半貼壁細(xì)胞，可在不需要對細(xì)胞進(jìn)行馴化和改造的情況下直接在培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，這為大規(guī)模高密度培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞創(chuàng)造了必要條件，因而其作為外源蛋白的表達(dá)細(xì)胞具有較明顯優(yōu)勢。

BEVS作為疫苗生產(chǎn)用表達(dá)系統(tǒng)已進(jìn)行了廣泛研究并取得了大量成果。人用疫苗研究方面，GSK公司應(yīng)用BEVS系統(tǒng)研制的HPV16/18雙價疫苗，已于2007年獲得批準(zhǔn)上市[12-13]，另有多項采用該表達(dá)系統(tǒng)的人類亞單位疫苗進(jìn)入Ⅱ期和Ⅲ期臨床研究階段，如流感疫苗[14-15]、戊肝疫苗[16]、糖尿病疫苗[17]等。動物疫苗研究方面，Sf9昆蟲細(xì)胞已用于豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）基因工程亞單位疫苗的商品化制備[18]，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益。Sf9細(xì)胞作為BEVS系統(tǒng)常用的細(xì)胞株，必將在亞單位疫苗研發(fā)及產(chǎn)品制備中發(fā)揮重要作用，其安全性評價具有重要意義。

本研究根據(jù)獸用生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞系試驗研究指導(dǎo)原則和中國獸藥典的要求，將不同代次Sf9細(xì)胞接種于裸鼠皮下，結(jié)果顯示細(xì)胞接種后直至84 d均無結(jié)節(jié)形成，病理組織學(xué)檢測無異常，表明Sf9細(xì)胞對裸鼠不具有致瘤性，安全性良好，可用于疫苗生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Miller L K. Baculoviruses：high-level expression in insect cells[J]. Current Opinion in Genetics & Development，1993，3（1）：97-101.

[2]楊德強(qiáng)，李慧春，陳鵬飛，等. 豬流行性腹瀉病毒S1基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定[J]. 中國動物傳染病學(xué)報，2017，25（3）：18-22.

[3]周金龍，王同燕，顏世君，等. 偽狂犬病病毒gE基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（2）：180-184.

[4]黃?娟，袁?飛，韓先杰，等. 豬圓環(huán)病毒2 d亞型衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2016，24（9）：1346-1353.

[5]張永武，連?海，張錦霞，等. 表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建及鑒定[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37（3）：14-18.

[6]王?盛，謝芝勛，羅思思，等. H5N1亞型禽流感病毒HA基因在sf9細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2017，47（10）：1281-1286.

[7]王安平，朱善元，王永娟，等. 鴨源新城疫病毒NP基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及抗原性檢測[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31（6）：1384-1388.

[8]張?磊. NDV7793-HN蛋白在SF9細(xì)胞中的表達(dá)[D]. 南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2017.

[9]王?芳，胡?波，任雪楓，等. 兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及對家兔的免疫保護(hù)效果[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（10）：1382-1387.

[10]獸用生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞系試驗研究指導(dǎo)原則[M]. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第683號：31.

[11]萬?婧，相興偉，江玲麗，等. 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在復(fù)合體重組表達(dá)應(yīng)用中的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報，2014（2）：7-14.

[12]la Torre G，de Waure C，Chiaradia G，et al. The health technology assessment of bivalent HPV vaccine cervarix in Italy[J]. Vaccine，2010，28（19）：3379-3384.

[13]孫?博. 應(yīng)用昆蟲細(xì)胞表達(dá)預(yù)防性人乳頭瘤病毒疫苗和應(yīng)用填充床生物反應(yīng)器表達(dá)H1N1流感病毒疫苗的研究[D]. 長春：吉林大學(xué)，2012.

[14]Cox M M，Patriarca P A，Treanor J F. A recombinant hemagglutinin influenza vaccine[J]. Influenza and Other Respiratory Viruses，2008，2（6）：211-219.

[15]Pushko P，Kort T，Nathan M，et al. RecombinantH1N1 virus-like particle vaccine elicits protective immunity in ferrets against the 2009 pandemicH1N1 influenza virus[J]. Vaccine，2010，28（30）：4771-4776.

[16]Shrestha M P，Scott R M，Joshi D M，et al. Safety and efficacy of a recombinant hepatitis E vaccine[J]. New England Journal of Medicine，2007，356（9）：895-903.

[17]Peakman M，Tree T I，Endl J，et al. Characterization of preparations of GAD65，proinsulin，and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes：report of phase Ⅱ of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes[J]. Diabetes，2001，50（8）：1749-1754.

[18]Felberbaum R S. The baculovirus expression vector system：A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors[J]. Biotechnology Journal，2015，10（5）：U85-702.