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    耐鹽促生菌的篩選、鑒定及其對黃瓜的促生作用

    2019-11-28 10:54:11錢蘭華錢瑋沈雪林胡翠英劉乾蔣晨威朱昫飏王桃云
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年18期

    錢蘭華 錢瑋 沈雪林 胡翠英 劉乾 蔣晨威 朱昫飏 王桃云

    摘要:為獲得耐鹽促生菌株并明確其促生特性,通過耐鹽試驗和ACC脫氨酶活性對沿海灘涂鹽堿地土壤中的微生物進(jìn)行分離篩選,得到5株耐鹽菌株,其中B7的耐鹽活性最強。接著采用平皿法和盆栽法研究了鹽脅迫下黃瓜種子發(fā)芽及盆栽試驗中B7對黃瓜的耐鹽促生作用。同時對B7的多種促生能力進(jìn)行測定,最后通過菌株形態(tài)、生理生化特征測定及其16S rDNA序列鑒定出B7菌株為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。研究結(jié)果表明,該菌株能明顯提高黃瓜耐鹽促生能力,同時具有產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)、產(chǎn)氨、固氮及解磷等多種促生能力,因而具有廣泛的應(yīng)用前景。

    關(guān)鍵詞:耐鹽;分離篩選;鑒定;巨大芽孢桿菌;黃瓜;促生作用

    中圖分類號: S154. 39文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2019)18-0160-04

    收稿日期:2018-05-31

    基金項目:江蘇省蘇州市科技計劃項目-應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃(編號:SYN201525)。

    作者簡介:錢蘭華(1976—),女,江蘇興化人,副教授,主要從事植物病蟲害綜合防治研究。E-mail:lanhuaqian@126.com。

    通信作者:王桃云,博士,副教授,主要從事植物、微生物資源研究。E-mail:wangtaoyun@usts.edu.cn。

    土壤鹽漬化是一個全球性的農(nóng)業(yè)問題,是當(dāng)前威脅全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因子,目前全球有50%的灌溉土地受到不同程度的鹽害[1]。中國鹽漬土壤的分布范圍廣、類型多,總面積約1億hm2,而且鹽堿地面積正逐年增加[2]。如何改良和利用大面積鹽漬化土地,以及保護(hù)并提高重要的經(jīng)濟(jì)作物抵抗鹽脅迫的能力是當(dāng)前國際社會亟待解決的重要農(nóng)業(yè)科技問題。目前,主要生物改良方法是培育并種植耐鹽堿作物,如種植檉柳、水稻、向日葵以及耐鹽植物田菁、紫穗槐等,此外還有耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的研究,但該類方法往往周期長、花費大,同時,植物轉(zhuǎn)基因方法還未被社會廣泛接受和認(rèn)可[3]。

    根際微生物是指在植物根系土壤范圍內(nèi)生長繁殖細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物。大多數(shù)根際微生物對植物無害且對植物生長有促進(jìn)作用。這些根際微生物具有固氮、溶磷、產(chǎn)生植物生長激素、鐵載體以及誘導(dǎo)植物抗性的功能。利用根際微生物提高鹽堿地作物耐鹽促生能力的方法具有投資少、見效快、效益高等特點。因此有關(guān)根際微生物耐鹽促生的功能活性研究已經(jīng)受到相關(guān)研究者的廣泛關(guān)注[4]。

    本研究擬對沿海灘涂植物根系周圍土壤中耐鹽微生物進(jìn)行篩選,并對篩選出的優(yōu)勢耐鹽菌株耐鹽特性、多種促生能力及其對鹽脅迫下黃瓜種子發(fā)芽及盆栽試驗中的耐鹽促生作用進(jìn)行研究。最后通過菌株形態(tài)、生理生化特征測定及其16S rDNA序列初步鑒定出耐鹽優(yōu)勢菌株的種屬,以期為提高農(nóng)作物抗鹽能力提供新策略。

    1?材料與方法

    1.1?樣品采集

    土樣采自江蘇省南通市啟東呂四鎮(zhèn)的海邊灘涂,土壤采樣深度為5~20 cm,采回的土壤經(jīng)風(fēng)干、粉碎后過100目篩待用。

    1.2?主要儀器

    超凈工作臺(SW-CJ-1FD),上海新苗醫(yī)療器械公司;高速冷凍離心機(Fresco 17),美國Thermo公司;高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-50FB),上海博迅實業(yè)有限公司;數(shù)顯pH計(PHS-3TC),上海天達(dá)儀器有限公司;紫外可見分光光度儀(UV-2450),日本島津公司;恒溫?fù)u床(TS-2102),上海天呈實驗儀器制造有限公司;光學(xué)顯微鏡(CX21),日本奧林巴斯公司。

    1.3?主要試劑與培養(yǎng)基

    2-羥基丁二酸,2-甲基-3-羥基-4,5-二羥甲基吡啶鹽酸鹽,哌嗪-1,4-二乙磺酸,吲哚-3-乙酸,三氧化鉬,乙二胺四乙酸鐵鈉等購于上海阿拉丁生化科技有限公司;胰蛋白胨,酵母粉,瓊脂粉,氯化鈉,α-氨基吲哚基丙酸,維生素H,考馬斯亮藍(lán),奈斯勒試劑和鉬酸鈉等購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    LB培養(yǎng)基,無機磷和有機磷培養(yǎng)基,CAS檢測平板,AF培養(yǎng)基,DF培養(yǎng)基和ADF培養(yǎng)基,無色氨酸King培養(yǎng)基,WA培養(yǎng)基,NA培養(yǎng)基等[5-7]。

    1.4?耐鹽菌株的分離篩選

    1.4.1?土壤菌株分離純化?取處理好的土樣1 g懸浮于裝有100 mL無菌水的250 mL三角錐形瓶中,在30 ℃、180 r/min 搖床中振蕩30 min,靜置10 min,得到土壤懸浮液。然后將此懸浮液稀釋為原始濃度的10-1~10-5倍,涂布于LB培養(yǎng)基平板上,于30 ℃在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,挑取各種不同類型的單菌落,經(jīng)過多次平板純化后,接種于LB斜面并在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2?菌株耐鹽能力測定[8]?利用含一定NaCl濃度的NA培養(yǎng)基篩選耐鹽菌株。用移液器分別取土壤稀釋液0.1 mL涂布于鹽濃度為6%的培養(yǎng)基平板上,30 ℃培養(yǎng)3 d,以相同條件下各平板中菌落數(shù)量多少來篩選耐鹽優(yōu)勢菌株。

    1.4.3?耐鹽菌株ACC脫氨酶活性測定

    通過制作α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定α-丁酮酸含量:按照趙龍飛等所述方法[9],測定菌株粗酶液在540 nm波長下的吸光度,并以α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo),以吸光度(D540 nm)為縱坐標(biāo),繪制α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算粗酶液中的α-丁酮酸含量。

    ACC脫氨酶比活力測定:參照Bradford的方法[10]比色測定細(xì)胞提取液中總蛋白質(zhì)含量,以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物,繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考Saleh等的方法[11],以反應(yīng)體系中每毫克菌體蛋白酶每小時催化ACC脫氨生成α-丁酮酸的微摩爾量表示ACC脫氨酶活性,其單位為μmol/(mg·h),設(shè)置空白對照。測定結(jié)果為3次重復(fù)值。

    1.5?優(yōu)勢耐鹽菌株B7的各種促生能力測試

    1.5.1?B7固氮能力的測定[12]

    活化細(xì)菌,挑取單菌落于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)18 h,分別吸取10 μL菌液到固氮培養(yǎng)基(NFb)平板上,菌株能在NFb中生長,且能使培養(yǎng)基變藍(lán)者視為有固氮活性,記錄為“+”,不變色記錄為“-”。

    1.5.2?B7菌株解磷能力測定

    參照Ribeiro等所述方法[13-14],活化B7菌株,挑取單菌落于2 mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)18 h,分別吸取10 μL菌液到有機磷培養(yǎng)基(OPA)和無機磷培養(yǎng)基(NPA)平板上,28~30 ℃培養(yǎng)96 h。觀察方法:NPA平板上有無透明圈,有透明圈者記錄為“+”,無透明圈者記錄為“-”;OPA平板上有渾濁斑記為“+”,無渾濁斑則記錄為“-”;

    1.5.3?B7菌株產(chǎn)嗜鐵素活性的檢測

    通過CAS檢測平板法進(jìn)行細(xì)菌產(chǎn)嗜鐵素活性檢測[15]。根據(jù)檢測平板中是否產(chǎn)生橘黃色暈圈來判斷菌株是否能產(chǎn)生嗜鐵素。觀察方法:CAS平板上有橘黃色暈圈者記錄為“+”,無橘黃色暈圈者記錄為“-”。

    1.5.4?B7菌株產(chǎn)IAA能力測定

    參照Wichner等的方法[16-17],將分離純化后的菌株接種于具有L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)24 h。取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上,加入等量Salkowski顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng),同時以加入等量IAA標(biāo)準(zhǔn)液作為陽性對照,在室溫、避光條件下放置顯色0.5 h,顏色變紅者表示能夠產(chǎn)生IAA。

    1.5.5?B7菌株產(chǎn)氨能力測定

    產(chǎn)氨能力的測定參照康貽軍等的方法[5]。將菌株轉(zhuǎn)接到含10 mL蛋白胨水(10 g/L)試管中,28 ℃培養(yǎng)48 h,每管加入0.5 mL Nesslers試劑,顏色由褐色轉(zhuǎn)為黃色的表明有氨產(chǎn)生。試管中溶液由褐色轉(zhuǎn)為黃色者記錄為“+”,試管中溶液不變色者記錄為“-”。

    1.5.6?菌株賦值評估

    根據(jù)以上促生能力測試結(jié)果,對耐鹽優(yōu)勢菌B7的促生潛力進(jìn)行賦值評估,具有某種促生能力時賦1分,沒有該促生能力時賦0分。

    1.5.7?B7菌株酸產(chǎn)堿能力測定

    取B7菌懸液200 μL加到NFM培養(yǎng)基(50 mL)中,在搖床上以180 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)3 d。觀察顏色,若培養(yǎng)液變成黃色則說明此菌株是產(chǎn)酸菌株;若變成藍(lán)色則說明此菌株是產(chǎn)堿菌株。

    1.6?耐鹽生長曲線的測定

    配制不同氯化鈉濃度(2%、4%、6%、8%、10%)的LB液體培養(yǎng)基,將B7接種至不同鹽濃度的培養(yǎng)基中,在搖床上以180 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后取出,在600 nm波長下測定其吸光度,以鹽濃度為橫坐標(biāo),D值為縱坐標(biāo),制作耐鹽生長曲線。

    1.7?菌株理化性質(zhì)檢測

    參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)[19]進(jìn)行耐鹽優(yōu)勢菌株B7的形態(tài)和生理生化鑒定。

    1.8?菌株B7分子學(xué)鑒定

    將菌株用LB液體培養(yǎng)液培養(yǎng)至對數(shù)生長期,離心收集菌體,采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒,提取總基因組DNA,采用通用引物27F/1492R(正向引物5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,反向引物:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增。產(chǎn)物測序后,將測序的結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進(jìn)行比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以確定菌株的分類。

    1.9?菌株B7對黃瓜發(fā)芽的促生試驗

    取黃瓜種子適量放入燒杯中進(jìn)行消毒滅菌,然后用無菌水清洗3次;把上述已清洗好的黃瓜種子放入耐鹽菌株B7菌液中浸泡6 h,備用。準(zhǔn)備適量的培養(yǎng)皿,將脫脂棉平鋪在培養(yǎng)皿底層,蓋好后滅菌待用;配置不同鹽濃度的氯化鈉溶液,滅菌后倒入培養(yǎng)皿中并沒過脫脂棉,做好標(biāo)記;將已經(jīng)浸泡過菌液的黃瓜種子放入不同鹽濃度的培養(yǎng)皿中,每個培養(yǎng)皿中放40個種子(以加蒸餾水的培養(yǎng)皿作為空白對照),放入光照培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)7 d(前3 d暗培養(yǎng),后4 d12 h光照培養(yǎng),12 h暗培養(yǎng));試驗結(jié)束后記錄黃瓜種子發(fā)芽率、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量(每組3個重復(fù))。

    1.10?菌株B7對盆栽黃瓜的促生試驗

    取黃瓜種子適量放入燒杯中進(jìn)行消毒滅菌,然后用無菌水清洗3次;把上述已清洗好的黃瓜種子放入耐鹽菌株B7菌液中浸泡6 h,備用。采用營養(yǎng)土與蛭石(體積比4 ∶1)混合得到盆栽基質(zhì),然后在121 ℃滅菌1 h,冷卻后裝至穴盆中(長10 cm×寬10 cm×高10 cm),每盆裝入200 g。分別設(shè)置空白對照組(無鹽脅迫)、鹽脅迫組和鹽脅迫加菌組,每組做5個重復(fù)。每盆種入處理好的黃瓜種子3粒(鹽加菌組的種子先用菌株B7菌液浸泡6 h,空白組和鹽脅迫組用滅菌水浸泡6 h),接著用不同溶液澆灌(空白組用無菌水澆灌,鹽加菌組用菌株B7菌液混合200 mmol/L NaCl溶液澆灌,鹽脅迫組用200 mmol/L NaCl溶液澆灌),每周澆灌處理1次,其余時間都澆灌無菌水,出苗后,算出發(fā)芽率和出苗率,然后每盆保留1株幼苗,1個月后測定總根長、總投影面積、總根表面積、平均根系直徑和根尖數(shù)等生長指標(biāo)及可溶性糖、賴氨酸含量等生理指標(biāo)。

    1.11?數(shù)據(jù)分析

    采用Excel 2010作圖,SPASS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    2?結(jié)果與分析

    2.1?耐鹽細(xì)菌的分離篩選

    采用平板稀釋法共分離出27株菌株,經(jīng)過耐鹽試驗的定性篩選,共有5株耐鹽菌株。耐鹽菌株命名分別為B1、B3、B5、B6和B7,其余22個菌株都沒有在6%鹽濃度的平板上長出來。5個菌株耐鹽試驗結(jié)果(表1)顯示,B7菌株的耐鹽活性最強。同時,菌株ACC脫氨酶活性試驗結(jié)果(表2)顯示,菌株B7的ACC脫氨酶活性最強,達(dá)到0.852 U/(mg·h)。由耐鹽試驗和各菌株ACC脫氨酶活性試驗結(jié)果可知,B7菌株的耐鹽能力和ACC脫氨酶活性都優(yōu)于其他幾個耐鹽菌株,因此選擇B7菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

    [12]楊敬輝,文平蘭,莊義慶. 頡頏細(xì)菌的篩選及生防潛能評估[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2013,26(2):565-571.

    [13]Ribeiro C M,Cardoso E J. Isolation,selection and characterization of root-associated growth promoting bacteria in Brazil Pine (Araucaria angustifolia)[J]. Microbiological Research,2012,167(2):69-78.

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