農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜過程中柱頭頂端開裂時期的確定

王寧寧 王偉杰 王玉康 曹維 李明 Sundus Zafar 胡茂龍 浦惠明 譚小力

摘要：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法（floral-dip）是一種簡便、快速、高效、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化法，在擬南芥中已得到了廣泛的應(yīng)用，但由于諸多因素的影響，其在油菜中的轉(zhuǎn)化效率受到了很大的制約。以甘藍(lán)型油菜為研究對象，通過對雌蕊柱頭開裂時間的研究，發(fā)現(xiàn)即將開放的10～15個花苞的柱頭是裂開的，此時最有利于農(nóng)桿菌進(jìn)入子房室完成轉(zhuǎn)化。對這部分花蕾進(jìn)行浸花法轉(zhuǎn)化，得到的T1代種子發(fā)芽后通過除草劑篩選獲得抗性轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步對這些植株進(jìn)行PCR驗證，其陽性率高達(dá)72.7%。該研究能進(jìn)一步提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率，實現(xiàn)甘藍(lán)型油菜更有效的遺傳轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜;浸花法;柱頭開口;轉(zhuǎn)化效率;農(nóng)桿菌

中圖分類號： S634.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0114-03

收稿日期：2018-06-30

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2016YFD0100305）。

作者簡介：王寧寧（1991—），男，山東濟(jì)南人，碩士研究生，研究方向為甘藍(lán)型油菜功能基因組學(xué)。E-mail：wnn517tdx@163.com。

通信作者：譚小力，博士，研究員，研究方向為植物細(xì)胞中油脂合成代謝調(diào)控的關(guān)鍵因子和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、多倍體植物功能基因組研究策略的建立、外源基因在植物中高水平表達(dá)及合成生物學(xué)平臺的構(gòu)建。E-mail：xltan@ujs.edu.cn。

油菜是四大油料作物之一，位居全球五大經(jīng)濟(jì)作物之列，是食用植物油和蛋白的重要來源。在油菜的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，科研人員越來越青睞應(yīng)用基因工程改良油菜品種，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，用于外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法越來越多，大體可分成2類：一類是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法;另一類是外源基因直接導(dǎo)入法，如基因槍法、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法、電擊法、激光微束穿刺法、顯微注射法和花粉管通道法等[1-5]。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中運用得最多。1985年，Horsch首次利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜[6]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化是由真空滲透（vacuum infiltration in planta）轉(zhuǎn)化法[7-8]簡化而來的[9-10]，只需將植株的花序浸泡在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液中幾分鐘，然后等種子成熟后即可通過篩選得到轉(zhuǎn)基因的種子[11]。付紹紅等在對甘藍(lán)型油菜進(jìn)行浸花法轉(zhuǎn)化后，通過GUS（-葡萄糖苷酸酶）和GFP（綠色熒光蛋白）報告基因的瞬時表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化植株未受傷的葉片表面、子房表皮、蜜腺、柱頭均檢測到GUS活性或GFP蛋白表達(dá)[12]。這說明農(nóng)桿菌有可能通過以上部位進(jìn)入受體植株細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化過程。之前的研究表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化主要侵染的是雌蕊而不是雄蕊，雌蕊中的胚珠是轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞[13]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的子房室不總是關(guān)閉，卵細(xì)胞發(fā)育突出，會延伸成瓶狀結(jié)構(gòu)并在頂部開口，花發(fā)育后期子房室頂部閉合。轉(zhuǎn)化一般在花開放前5～10 d進(jìn)行，此時雌蕊開放，農(nóng)桿菌得以進(jìn)入子房并將T-DNA轉(zhuǎn)移到卵細(xì)胞[14]。油菜的發(fā)育與擬南芥類似，胚珠在最初發(fā)育階段，先形成1個細(xì)胞環(huán)，進(jìn)而形成1個頂端開口的瓶狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的頂端約在開花前3 d形成柱頭，隨后頂端開口閉合，在此之前轉(zhuǎn)化都有可能發(fā)生[15]。花開放后短時間內(nèi)即完成授粉受精過程且柱頭頂端已經(jīng)閉合，此時的雌蕊已不適合進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因此，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法進(jìn)行轉(zhuǎn)化時往往選擇未開放的花蕾。本研究中，筆者通過對未開放花的雌蕊柱頭開裂時間的研究，探究了農(nóng)桿菌進(jìn)入雌蕊子房室的最佳時間，從而能進(jìn)一步提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率，實現(xiàn)甘藍(lán)型油菜更有效的遺傳轉(zhuǎn)化。

1?材料與方法

1.1?材料

以甘藍(lán)型油菜中雙11為研究材料，材料由筆者所在實驗室提供。含有攜帶Bar基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，菌種由筆者所在實驗室提供。試驗時間：2018年4月;試驗地點：江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院油菜試驗田。

1.2?方法

1.2.1?雌蕊的固定及觀察

取正常生長的油菜開花期待開放的花蕾，從靠近已開放花朵的第1個花蕾開始，由下至頂端依次取樣并編號，將未開放的第1個花蕾命名為01號，第2個花蕾命名為02號，依次往上取樣（對應(yīng)的雄蕊編號分別為C01、C02……）。將花萼、花瓣及雄蕊去除，測量雌蕊長度并記錄，然后將雌蕊置于福爾馬林-醋酸-乙醇（FAA）固定液中[16]，于4 ℃固定24 h。固定好后用掃描電鏡觀察柱頭開口時間的差異情況。

1.2.2?農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化油菜

將含有攜帶Bar基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌通過浸花法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜中雙11。浸花前將已開放的花剪掉，保留10～15個待開放的花蕾用于浸花，將其余幼嫩的花蕾剪掉。將攜帶轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌接種于250 mL LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)至D600 nm為0.8～1.0左右，離心后用250 mL MS液體培養(yǎng)基重懸，并加入乙酰丁香酮、6- 芐氨基腺嘌呤（6-BA）及SilwetL-77。將花蕾浸入農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡5 min，浸花完成后套上羊皮紙帶，花期結(jié)束后摘掉紙袋。待種子成熟后收獲、儲存[17]。

1.2.3?陽性轉(zhuǎn)化株的篩選

用于轉(zhuǎn)化的載體上攜帶有1個抗除草劑的篩選標(biāo)記基因Bar，如圖1所示，因而可以利用除草劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的篩選。將浸花后收獲的T1代油菜種子播種于托盤中，待幼苗長出1張真葉時通過噴灑除草劑篩選出陽性的轉(zhuǎn)化株[18]。提取除草劑篩選后存活下來的油菜幼苗葉片基因組進(jìn)行PCR驗證，PCR擴(kuò)增片段位置如圖1所示，PCR擴(kuò)增的引物序列如下：

Bar-F：5′-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAAA-3′;

Bar-R：5′-CTGCACCATCGTCAACCACTA-3′。

2?結(jié)果與分析

2.1?柱頭開裂情況觀察

利用掃描電鏡對FAA固定的甘藍(lán)型油菜雌蕊柱頭進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)并不是所有未開放花蕾的雌蕊柱頭都是開口的，如圖2所示，在所有掃描的雌蕊柱頭中，只有編號靠前的10個左右的柱頭是開口的，即最接近開放的10朵左右的花蕾柱頭是開口的，這一部分花蕾在進(jìn)行農(nóng)桿菌浸花時，農(nóng)桿菌最有可能通過柱頭上的開口進(jìn)入子房內(nèi)部，進(jìn)而完成轉(zhuǎn)化。

如圖3所示，通過對雌蕊長度的測量，可以發(fā)現(xiàn)柱頭開口的這一部分（C01～C12）雌蕊較其他雌蕊長度略長，發(fā)育較早，距離開花的時間也相對較短，便于進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2.2?陽性轉(zhuǎn)化株的篩選

對浸花法轉(zhuǎn)化得到的油菜種子萌發(fā)后的幼苗噴灑除草劑處理，部分油菜幼苗存活了下來，如圖4所示。由于進(jìn)行轉(zhuǎn)化的載體上含有除草劑抗性基因Bar，其轉(zhuǎn)基因植株對除草劑具有一定程度的抗性。因此這部分存活下來的油菜幼苗很有可能是轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)基因植株。

2.3?陽性轉(zhuǎn)化株的分子鑒定

提取存活油菜幼苗的葉片基因組，PCR擴(kuò)增Bar基因（圖1）中444 bp的片段，由此來進(jìn)一步驗證存活的幼苗是否為轉(zhuǎn)基因植株。如圖5所示，存活植株中有很大一部分都擴(kuò)增出了與質(zhì)粒對照相同大小的條帶，說明這部分植株確實為轉(zhuǎn)基因植株，存活植株的陽性率約為72.7%。以上結(jié)果表明，對柱頭開口時間的正確把握，對于提高油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要作用。

3?討論

隨著甘藍(lán)型油菜研究的不斷深入，建立一種高效、便捷的油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系是非常有必要的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法是一種簡便、快速、高效、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化法，對于甘藍(lán)型油菜的研究具有重要意義，已經(jīng)應(yīng)用到了油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中[19-22]，但在實際應(yīng)用中存在的各種因素導(dǎo)致油菜轉(zhuǎn)化效率非常低。本試驗通過掃描電鏡，對油菜雌蕊柱頭的開口時間進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)并不是所有未開放花蕾的雌蕊柱頭都是開口的，只有最接近開放的10～15個的花蕾柱頭是開口的。這一部分花蕾在進(jìn)行農(nóng)桿菌浸染時，由于雌蕊頂端有開口，便于農(nóng)桿菌進(jìn)入子房內(nèi)部，進(jìn)而完成轉(zhuǎn)化。對浸花法獲得的油菜種子萌發(fā)后的幼苗進(jìn)行除草劑篩選及PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)存活下來的油菜幼苗為轉(zhuǎn)基因植株的比例達(dá)到72.7%，這一結(jié)果也證實了該方法的可靠性，即通過正確把握油菜雌蕊的開口時間，選擇最恰當(dāng)?shù)挠筒嘶ɡ龠M(jìn)行浸花轉(zhuǎn)化，將會大大提高油菜的遺傳轉(zhuǎn)化效率，對甘藍(lán)型油菜的研究具有重要意義。

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