植物非特異性磷脂酶C的研究進(jìn)展

帥良 孫健 段振華 李麗 何雪梅 李昌寶 廖玲燕

摘要：非特異性磷脂酶C（non-specific PLC，NPC）能夠水解磷脂酸膽堿和磷脂酰乙醇胺生成二?；视停╠iacylglycerol，DAG），雖然非特異性磷脂酶C沒有PLC家族基因的C2、X、Y、EF等結(jié)構(gòu)域，但它仍含有1個(gè)磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域，能夠水解磷脂。近年來研究發(fā)現(xiàn)，非特異性磷脂酶C在植物逆境脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。因此本文對(duì)非特異性磷脂酶C的結(jié)構(gòu)、生理功能及其作用機(jī)制進(jìn)行概述，并對(duì)其研究前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：非特異性磷脂酶C;二?；视?逆境脅迫;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

中圖分類號(hào)：S184?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）18-0030-08

收稿日期：2018-06-11

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：201303073）;國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31560467、31160407、31660589）;2014年國家中組部“萬人計(jì)劃”青年拔尖人才項(xiàng)目（編號(hào)：組廳字[2015]48號(hào)）;“八桂學(xué)者”工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（編號(hào)：[2016]21）;廣西創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展專項(xiàng)資金（編號(hào)：桂科AA17204038、桂科AA17204042）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后基金（編號(hào)：桂農(nóng)科博2018029）;廣西特聘專家專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（編號(hào)：廳發(fā)[2016]21號(hào)）;廣西果蔬保鮮與深加工人才小開放課題（編號(hào)：2016XGDSHFW02）;現(xiàn)代食品加工新技術(shù)研究崗位創(chuàng)新人才培養(yǎng)示范基地建設(shè)（編號(hào)：桂科AD17195088）。

作者簡介：帥?良（1986—），男，江西新干人，博士，講師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏技術(shù)研究。Tel：（0771）3240232;E-mail：shuailiang1212@163.com。

通信作者：孫?健，博士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工技術(shù)研究。Tel：（0771）3240692;E-mail：jiansun@gxaas.net。

磷脂酶（phospholipases）是一類能夠水解磷脂的酶類，根據(jù)其水解磷脂位點(diǎn)的不同可將其分為磷脂酶A1（phospholipases A1，PLA1）、磷脂酶A2（PLA2）、磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）[1]，它們均在植物生長發(fā)育、生物脅迫及非生物脅迫中起重要的調(diào)控作用。其中PLC介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最經(jīng)典的通路之一，它能夠水解磷脂生成1分子的二?；视停╠iacylglycerol，DAG）和1個(gè)含有磷酸基團(tuán)的小分子[2]。植物中的PLC根據(jù)水解底物和功能的不同可以分為3類：第1類為能夠水解磷脂酸膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）并生成DAG的非特異性磷脂酶C（non-specific PLC，NPC）;第2類為能夠水解4，5二磷酸肌醇（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）生成三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3）和DAG的磷酸肌醇特異性磷脂酶C（phosphoinositide-specifc PLC，PI-PLC）;第3類為能夠水解連接在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的糖基磷脂酰肌醇錨蛋白的糖基磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（glycosylphosphatidylinositol PLC，GPI-PLC）[3]。NPC最先在產(chǎn)氣莢膜梭菌中被發(fā)現(xiàn)[4]。1955年，在植物質(zhì)體中發(fā)現(xiàn)了類似NPC的活性[5]。目前為止，已經(jīng)從擬南芥[6]、水稻[7]、谷子[8]、陸地棉[9]等植物中克隆出NPC基因成員。近年來，大量研究結(jié)果表明，NPC類基因在植物處于干旱、高鹽、低磷等非生物脅迫條件下時(shí)發(fā)揮重要的作用，并參與脫落酸（ABA）、油菜素內(nèi)酯（BL）等激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑[10]。本文結(jié)合近幾年來國內(nèi)外NPC功能、分類和結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展，綜述其參與不同植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，對(duì)NPC在植物中的作用機(jī)制及其行使的相關(guān)功能作一個(gè)簡要總結(jié)。

1?NPC的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

早期研究認(rèn)為，植物NPC基因與其他已知的植物磷脂酶基因家族成員沒有任何關(guān)系，隨著研究的不斷深入，多序列比對(duì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥NPC與結(jié)核分支桿菌的PLC同源性相近，并且具有3個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域[11]。高等植物的基因組通常包含幾個(gè)基因編碼家族，NPCs蛋白一般是由510～540個(gè)氨基酸殘基組成。NPC蛋白含有1個(gè)主要的磷酸酯酶域，具有典型的酯酶活性（圖1）。NPC蛋白不像其他植物脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白一樣含有C2、XY、EF、PH、PX、ENTH、FYVE等結(jié)構(gòu)域。多數(shù)植物的NPCs蛋白在N端都含有1個(gè)信號(hào)肽，信號(hào)肽后面接著是1個(gè)短的可變區(qū)域和1個(gè)包含ENRSFDxxxG序列的高度保守結(jié)構(gòu)域，這個(gè)保守區(qū)域在磷脂酸結(jié)構(gòu)域的開頭部位。但是這個(gè)D端的信號(hào)肽在擬南芥NPC3、NPC4和NPC5蛋白中并未發(fā)現(xiàn)。TxPNR和DExxGxxDHV 2個(gè)不變的結(jié)構(gòu)域在NPC蛋白的中間部位，在磷脂酸結(jié)構(gòu)域的尾部有1個(gè)GxRVPxxxxxP結(jié)構(gòu)域。在蛋白質(zhì)C端的50～100個(gè)氨基酸序列是NPC序列最分散的部分，不同的NPC亞族具有不同的長度和保守序列。這部分序列通過與其他蛋白相互作用和確定蛋白質(zhì)的位置，使得不同的NPC亞型具有不同的功能[11]（圖1）。

分析擬南芥AtNPC2蛋白的3D模型發(fā)現(xiàn)，它和土拉桿菌的酸性磷酸酶（AcpA）結(jié)構(gòu)類似。植物PC-PLC的蛋白骨架是由β折疊和若干α螺旋組成的內(nèi)涵蛋白構(gòu)成（圖2）。研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成土拉細(xì)菌AcpA活性部位的大多數(shù)氨基酸殘基都是保守的，包括與未識(shí)別的金屬陽離子結(jié)合的位點(diǎn)[13]。

AtNPC2蛋白預(yù)測模型發(fā)現(xiàn)，可變的C端包含1個(gè)帽子結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)保護(hù)了蛋白的活性中心，使得蛋白不能直接參與催化反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)與NPC蛋白序列分析結(jié)果一致。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，植物NPCs的活性位點(diǎn)形成了1個(gè)帶強(qiáng)烈負(fù)電荷的口袋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能與磷脂基質(zhì)的結(jié)合有關(guān)[13]。

2?NPC的生化特點(diǎn)和亞細(xì)胞定位

在大腸桿菌中重組表達(dá)擬南芥NPC4蛋白，體外活性測定發(fā)現(xiàn)NPC4蛋白對(duì)PC和PE均有水解活性，而對(duì)磷脂酸（PA）和PIP2的底物水解活性可以忽略不計(jì)[6，11]。Peters等研究發(fā)現(xiàn)，NPC4對(duì)磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerols，PG）具有一定的水解活性[6]。大腸桿菌重組表達(dá)擬南芥NPC5蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白能夠?qū)C和PE水解為DAG，但其水解活性比NPC4低40倍以上[14]。然而，重組表達(dá)的擬南芥NPC3蛋白則表現(xiàn)出將溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）水解成單酰基甘油的磷脂酶活性，而對(duì)其他磷脂質(zhì)不呈現(xiàn)水解活性[15]。體外測定擬南芥重組表達(dá)蛋白NPC1和NPC2活性發(fā)現(xiàn)，2個(gè)蛋白都具有NPC酶活性，都能夠?qū)C水解為DAG[16-17]。至今未見擬南芥NPC6活性研究的報(bào)道。在煙草和矮牽牛中的研究發(fā)現(xiàn)，在人工培養(yǎng)的煙草細(xì)胞和矮牽牛提取物中能夠鑒定出具有放射性標(biāo)記的DAG，推測其主要由NPC水解具有放射性標(biāo)記的PC而來[18-19]。

與其他依賴于Ca2+的磷脂酶不同，NPC4的活性與Ca2+濃度無關(guān)，但是加入EGTA能夠輕微增加其活性，造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于EGTA能夠抑制2價(jià)陽離子的螯合作用[11]。NPC3水解溶血磷脂酸的活性能夠被Triton X-100、NP-40和CHAPS等表面活性劑抑制，抑制程度與活性劑濃度大小呈正相關(guān)[15]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)NPC3的活性大小與Mg2+、Ca2+和Mn2+等金屬離子的濃度大小無關(guān)。植物體外NPC活性研究表明，在煙草懸浮細(xì)胞BY-2體系中高濃度Al3+（≥100 μmol/L AlCl3） 能夠抑制PC被水解[20]。 同樣在擬南芥中的研究也發(fā)現(xiàn)，Al3+能夠降低由PC水解生成的DAG的量[21]。Al3+能夠抑制NPC活性的主要原因是Al3+能夠誘導(dǎo)擬南芥細(xì)胞膜的物理性質(zhì)發(fā)生改變，從而影響細(xì)胞膜結(jié)合的NPC蛋白的活性[22]。在歐洲油菜中的研究發(fā)現(xiàn)，油菜類固醇激素24-EBR和鹽能夠增加NPC和PLD的活性[23]。雖然在動(dòng)物和細(xì)菌中有PC-PIC的直接抑制劑[24-25]，但是植物中尚未發(fā)現(xiàn)NPCs的特異性抑制劑。

通常來講，植物磷脂酶的亞細(xì)胞定位可以典型地分為細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞膜結(jié)合兩大類[3，26]。試驗(yàn)人員已經(jīng)在矮牽牛和煙草BY-2懸浮細(xì)胞的細(xì)胞膜上測定出NPC的活性[19-20]。研究人員在燕麥根的細(xì)胞膜上也發(fā)現(xiàn)了與擬南芥NPC4抗體起結(jié)合反應(yīng)的磷脂酶，由此推測燕麥根上具有NPC蛋白[27]。利用NPC4的多克隆抗體對(duì)擬南芥葉片的亞細(xì)胞組分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬南芥NPC4蛋白定位于細(xì)胞膜上[11]，通過構(gòu)建NPC4-GFP定位載體進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)論[14]。NPC3是在擬南芥液泡蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜鑒定中被發(fā)現(xiàn)的[28]，由此可知擬南芥NPC3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。但是，目前關(guān)于NPC3和NPC4的細(xì)胞定位決定因素至今仍不清楚。構(gòu)建NPC5-GFP定位載體發(fā)現(xiàn)，擬南芥NPC5蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中[14]。激光共聚焦顯微鏡分析顯示，水稻NPC1和NPC3分別定位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體上[29]，而NPC2主要定位于擬南芥根系的高爾基體上[17]。

3?NPC的生理功能

大量研究表明，NPC參與植物對(duì)環(huán)境和生物刺激的各種代謝反應(yīng)。在長期經(jīng)受生物和非生物脅迫、磷酸鹽缺乏和某些激素處理（生長素、細(xì)胞分裂素、ABA）的刺激條件下，植物NPC的活性和基因表達(dá)會(huì)發(fā)生改變。相反，當(dāng)植物受到鋁、油菜素內(nèi)酯和誘導(dǎo)子等刺激后，植物體內(nèi)NPC活性和DAG的含量會(huì)迅速發(fā)生改變。這些刺激反應(yīng)比從頭合成蛋白反應(yīng)更快，只需要30～45 min[30]。依據(jù)NPC在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中所起的作用，由此可將植物NPC列入到磷脂酶中。

3.1?NPC在非生物脅迫中的作用

磷脂信號(hào)在滲透和鹽脅迫條件下的防御反應(yīng)中起著重要作用。在低滲透作用的刺激下，鹽生杜氏藻的細(xì)胞膜中快速積累了大量的由PC水解而成的DAG[31]。使用100 mmol/L的NaCl處理擬南芥后3～6 h，擬南芥根中NPC4表達(dá)量增加了12倍[32]。與野生型擬南芥相比，敲除npc4基因的突變體在含有150 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基上播種時(shí)其萌發(fā)率顯著降低[32]。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，npc4基因的突變體在鹽和干旱脅迫條件下可以減少種子萌發(fā)率和整體生存能力。在鹽脅迫和高滲條件下，與野生型植株表現(xiàn)不同的是，過表達(dá)的NPC4突變體具有較高的種子萌發(fā)率、較大的根長度和干質(zhì)量[6]。在擬南芥的側(cè)根發(fā)育中，NPC5介導(dǎo)了其對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)。在鹽脅迫處理?xiàng)l件下，NPC5的表達(dá)量大幅度提高[33]。綜上所述，NPC在植物響應(yīng)鹽脅迫處理的過程中起著至關(guān)重要的作用。

鋁中毒可以通過細(xì)胞膜去極化、破壞離子通道和鈣離子穩(wěn)態(tài)等途徑迅速地抑制植物根生長[34-36]。在鋁脅迫期間，磷脂酶和脂類中間體被認(rèn)為是執(zhí)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝的主要角色[37]。通過對(duì)DAG形成和降解有關(guān)的代謝途徑研究發(fā)現(xiàn)，使用鋁處理的煙草懸浮BY-2細(xì)胞，NPC的活性決定了DAG積累量[20]。

同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，NPCs在植物的耐熱性中起重要作用。在37 ℃的熱脅迫下處理擬南芥2 h后，NPC3的表達(dá)量增加了14.6倍[38]。與野生型相對(duì)比，擬南芥中過表達(dá)NPC1后其耐熱性有了很大地提高，由此可知，NPC1參與植物對(duì)熱脅迫的響應(yīng)[16]。

3.2?NPC在生物脅迫中的作用

現(xiàn)已證實(shí)磷脂酶在植物的防御反應(yīng)中起著重要作用，為脂質(zhì)作用第二信使提供了重要依據(jù)[39-40]。Scherer等第1次證實(shí)NPC在植物防御反應(yīng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用[18]。在甜橙黃龍病的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甜橙感染黃龍病后，與擬南芥AtNPC5同源的甜橙NPC基因表達(dá)量增加了5倍，推測甜橙NPC基因在抗病過程中起作用[41]。擬南芥DNA微陣列數(shù)據(jù)顯示，接種假單孢桿菌后NPC基因家族（尤其是NPC6）的表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降;而接種灰霉菌、白粉菌、丁香假單胞菌和晚疫病菌的植株NPC3和NPC4的表達(dá)量上升[6]。使用來自細(xì)菌的激發(fā)子flg22和HprZ處理擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NPC1和NPC4表達(dá)量有所改變，表明NPCs在應(yīng)激過程和感知不同激發(fā)子能力時(shí)可能具有不同的功能。擬南芥接種丁香假單胞菌后NPC2表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降，造成表達(dá)下降的主要原因是當(dāng)遇到病原體攻擊時(shí)，植物需要迅速重新排列它們的代謝通量并激活防御系統(tǒng)[17]。在白粉虱感染過程中，NPC3表達(dá)量升高，表明NPC3可能參與了對(duì)害蟲的防御反應(yīng)[12]。由此可知，植物NPC在抵御微生物和病蟲害侵染的過程中起著重要作用。

NPC在防御反應(yīng)中的主要作用是水解磷脂產(chǎn)生DAG，再通過DAG激酶（DAG kinase，DGK）轉(zhuǎn)化生成PA或者其他脂質(zhì)第二信使。在胡蘿卜中的研究發(fā)現(xiàn)，DAG的合成能夠快速激活起防御反應(yīng)的植物抗毒素生成[42]。水稻中的研究表明，DAG和PA的產(chǎn)生還控制了活性氧的生成以及抗病激發(fā)子響應(yīng)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗病性[43]。使用N，N′，N″，N-四乙酰殼聚糖和flg22激活子處理番茄細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后能夠顯著提高細(xì)胞中PA的積累量，但其積累與PLD的活性無關(guān)，由此可知，DAG/DGK途徑在特定的植物防御反應(yīng)中起作用[44]。Zhang等研究表明，在擬南芥中DGK輔助DAG轉(zhuǎn)化生成PA是植物對(duì)損傷響應(yīng)的早期反應(yīng)[45]。使用殼聚糖和木聚糖酶誘導(dǎo)子處理懸浮液培養(yǎng)的紫花苜蓿細(xì)胞[46]和木聚糖酶誘導(dǎo)處理番茄細(xì)胞[47]中都觀察到了DAG/DGK途徑的PA生成。此外，水稻防御反應(yīng)的OsBIDK1基因在煙草中的表達(dá)增加了其對(duì)煙草花葉病毒和疫霉病的抗性，揭示DGK在脂質(zhì)信號(hào)通路中起著重要的作用[48]。

3.3?NPC在激素調(diào)節(jié)中的作用

植物激素的主要功能是包括由PLC和PLD在內(nèi)的眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)介導(dǎo)而成的。目前，關(guān)于NPCs如何參與調(diào)控植物激素的功能依然不是很清楚。在煙草中的研究發(fā)現(xiàn)，使用表油菜素內(nèi)酯（BL）處理BY-2細(xì)胞后可以快速誘導(dǎo)煙草細(xì)胞中NPC的活性增加[49]。擬南芥敲除npc3和npc4基因的突變體對(duì)BL的處理敏感性顯著降低，同時(shí)BL響應(yīng)基因TCH4和LRX2的表達(dá)量也發(fā)生了改變[49]。在NPC缺乏的植株中其對(duì)1-NAA生長素的敏感性是不變的，但在npc3基因的突變體植株中，參與生長素信號(hào)的IAA19和IAA20基因表達(dá)量顯著降低。此外，半定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，生長素、細(xì)胞分裂素和表油菜素內(nèi)酯對(duì)NPCs的表達(dá)水平都有影響[49]。當(dāng)使用玉米素處理3 h和表油菜素內(nèi)酯處理24 h后擬南芥NPC4的表達(dá)水平升高，而其他NPC基因的表達(dá)水平只有輕微的變化[49]。經(jīng)1-NAA或蕓苔素內(nèi)酯處理的擬南芥，其PNPC3 ∶GUS和PNPC4 ∶GUS基因的表達(dá)量在根尖、子葉、葉緣和花器官中顯著增強(qiáng)，表達(dá)變化和生長素合成基因DR5 ∶GUS類似[50]，由此可知，生長素、油菜素內(nèi)酯和NPC相互作用從而影響擬南芥根細(xì)胞的生長。研究還發(fā)現(xiàn)，PNPC2 ∶GUS的表達(dá)方式與富含生長素的根區(qū)相關(guān)，但當(dāng)使用IAA處理npc2突變體時(shí)，突變體在根系密度和長度上并沒有發(fā)生異常[51]。

使用SA、MeJA和ACC等激素處理擬南芥發(fā)現(xiàn)，只有SA處理使得NPC2的表達(dá)水平出現(xiàn)下降[17]，說明NPC2在相應(yīng)SA處理的過程中起作用。使用ABA、SA和MeJA等激素處理擬南芥后，發(fā)現(xiàn)只有ABA處理能夠誘導(dǎo)NPC4基因的表達(dá)發(fā)生變化，說明NPC4在響應(yīng)ABA處理的過程中起著重要作用[52]。在種子中積累了較高水平ABA的擬南芥npc4突變株對(duì)ABA處理不敏感，從而導(dǎo)致種子萌發(fā)、生長和氣孔運(yùn)動(dòng)異常[6]。使用ABA和鹽脅迫同時(shí)處理的npc4突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABA響應(yīng)基因（ABI1、ABI2、RAB18、PP2CA、OST1、RD29B、ERA1和SOT12）的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生較大的變化，從而重新喚起ABA信號(hào)途徑[6，32]。擬南芥植株中過表達(dá)NPC4基因會(huì)使得種子對(duì)ABA的敏感性提高從而抑制種子萌發(fā)，并且能夠提高其對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性，由此可知，NPC在ABA介導(dǎo)植物應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用[32]。在正常條件下，NPC4參與了DAG的生成并促使氣孔開放，在外界脅迫下，ABA水平提高從而誘導(dǎo)NPC4生成DAG，DAG在DGK的作用下被磷酸化為PA，PA進(jìn)一步促進(jìn)ABA的積累從而導(dǎo)致氣孔關(guān)閉[6]。

3.4?NPC在脂質(zhì)代謝中的作用

在植物中，NPC負(fù)責(zé)生成進(jìn)入細(xì)胞代謝途徑的DAG和磷脂膽堿。雖然研究發(fā)現(xiàn)，磷脂膽堿在植物脂質(zhì)代謝中并不起十分重要的作用，但是DAG卻是脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物[12]。在植物體中，DAG可以從甘油-3-磷酸代謝途徑中生成，也可以通過磷脂酶水解細(xì)胞膜磷脂獲得[53]。由于DAG具有疏水性，植物體中生成的DAG通常會(huì)結(jié)合在細(xì)胞膜上，細(xì)胞膜上的酶系統(tǒng)被用來精確地控制其運(yùn)轉(zhuǎn)[54]。根據(jù)其來源和細(xì)胞位置的不同，DAG的脂肪酸組成可以發(fā)生變化并由明顯不同的C18/C16和C18/C18構(gòu)成。在植物中，DAG的主要功能是作為甘油脂代謝的前體物質(zhì)。然而，不同細(xì)胞的DAG同時(shí)也參與了膜糖脂類、硫脂類、其他脂類的合成以及儲(chǔ)存類三酰基甘油的生物合成。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，DAG主要作為PC和PE合成的底物;而在質(zhì)體包膜中，DAG被轉(zhuǎn)變?yōu)閱熙セ；视停∕GDG）和硫脂類物質(zhì)[55-56]。DAG還可以通過2步轉(zhuǎn)化為環(huán)二膦酸-二?；视停@對(duì)光合作用和磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油及雙磷脂酰甘油的生物合成具有重要意義[57]。

有直接證據(jù)表明，在植物體中NPC能夠影響DAG的生成和其他脂類的平衡。與野生型相比，擬南芥npc4突變體在葉片中積累DAG的量較少[6]。在磷酸鹽缺乏的條件下，擬南芥npc4突變體的DAG生成量也顯著減少[11]。然而，在正常的條件下，npc4突變體產(chǎn)生的DAG分子種類和其他脂質(zhì)含量的總體分布并沒有顯著變化[6]。體外活性測定表明，NPC5的活性明顯低于NPC4，然而在缺磷的條件下，葉片中NPC5主要負(fù)責(zé)生成DGDG[14]。在擬南芥npc5突變體中雖然半乳糖脂的脂肪酸組成有所變化，但是半乳糖脂的含量和主要膜磷脂的含量并沒有改變[14]。

一些由DAG衍生的脂類似乎與植物激素的感知和抗逆性有關(guān)。當(dāng)擬南芥突變體缺乏DGDG合成酶時(shí)，在使用DAG作底物時(shí)表現(xiàn)出較差的耐熱性[58]。DAG衍生的SQDG脂類在植物的鹽脅迫中起著至關(guān)重要的作用[59]。DAG也可以通過DGK轉(zhuǎn)化為PA，進(jìn)而參與茉莉酸的生物合成[60]。

此外，由NPC水解生成的磷酸膽堿可以產(chǎn)生游離膽堿，而游離膽堿的生成能夠促進(jìn)甜菜堿[61]和膽堿-鄰硫酸鹽[62]的生物合成。

3.5?NPC在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用

DAG在動(dòng)物中的研究相對(duì)透徹，在動(dòng)物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中主要作為第二信使分子激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），再由PKC激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)[63-64]。PKC廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞中，屬于典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，其在N端調(diào)控域中存在1個(gè)DAG/磷脂結(jié)合的C1位點(diǎn)，該位點(diǎn)能夠被DAG分子強(qiáng)烈激活[65]?，F(xiàn)在還沒有直接證據(jù)表明植物蛋白激酶存在類似于動(dòng)物PKC的C1位點(diǎn)。然而，在許多擬南芥蛋白中推測出富含半胱氨酸和組氨酸的DAG結(jié)合位點(diǎn)，這其中包括PKC-like（protein kinase C-like-IPR002219）、C1-like位點(diǎn)（C1-like domain-IPR011424）和DC1（plant-specific‘divergent C1domain-IPR004146）等蛋白[12]。還發(fā)現(xiàn)了DGKs和包含鋅指及PHD鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，這些蛋白通過與DNA、RNA或者其他蛋白相結(jié)合從而執(zhí)行調(diào)節(jié)功能。另外，還從煙草中鑒定出識(shí)別脅迫響應(yīng)蛋白NtDC1A和NtDC1B[66]，從小麥種鑒定出脅迫響應(yīng)蛋白TaCHP[67]。在大麥和馬鈴薯的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)了DAG結(jié)合位點(diǎn)，這為DAG在基因調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用提供了可靠依據(jù)[12]。

大量研究表明，動(dòng)物體中PKCs參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和分化等活動(dòng)[65]。然而，在擬南芥或者其他植物中，盡管已經(jīng)鑒定出許多與動(dòng)物PKC在結(jié)構(gòu)和生物特性上相似的植物激酶，但是目前還沒有發(fā)現(xiàn)與PKC類似的同源序列。從大豆和水稻中分別克隆出編碼PVPK-1和G11A的蛋白激酶分析發(fā)現(xiàn)，它們具有PKC催化位點(diǎn)的特性，但是與PKC的催化結(jié)構(gòu)域不同[68]。玉米中參與硝酸還原酶基因表達(dá)的PKC型酶的活性受Ca2+、佛波酯（PMA）、磷脂或二酰基甘油合成類似物的調(diào)控[69]。早期的研究表明，在玉米中PMA在有PS和鈣存在的情況下激活了PKC-like酶的活性[70]。從白菜中純化的蛋白激酶在遇到Ca2+、二酰基甘油、磷脂或PMA時(shí)表現(xiàn)出典型的PKC酶特征[71]，使用PMA處理芥菜能夠激活芥菜中PKC-like蛋白激酶的活性[72]。

DAG在植物中的信號(hào)作用并不明顯，現(xiàn)仍處于爭論階段[73]。到目前為止，尚未在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)DAG應(yīng)答蛋白[74]。Munnik研究發(fā)現(xiàn)，DAG是PIP2水解產(chǎn)物，可以迅速被磷酸化為PA，而PA在植物信號(hào)過程中起著至關(guān)重要的作用[75]。在某些植物體系中，DAG也可能作為一種信號(hào)分子存在。在蠶豆中的研究表明，新合成的DAGs能夠引發(fā)細(xì)胞離子流動(dòng)，從而促使氣孔細(xì)胞的開放，這暗示DAG可能作為ABA信號(hào)調(diào)節(jié)的補(bǔ)充[76]。擬南芥Atlpp2-2突變體植株的磷脂酶活性很低，植株對(duì)ABA響應(yīng)受到破壞并且積累大量的PA，這時(shí)候的DAG主要由PA的去磷酸化生成[77]。在紫露草中的研究間接表明，DAG參與調(diào)節(jié)雄蕊毛細(xì)胞的周期性生長[78]。由此可知，DAG可以作為植物細(xì)胞中的信號(hào)分子，但這種信號(hào)級(jí)聯(lián)的分子性質(zhì)仍有待闡明。

Arisz等研究發(fā)現(xiàn)，由PI-PLC分解得到的DAG和由NPC分解得到的DAG在脂肪酸的組成上可能存在差異，這使得它們在調(diào)控植物代謝的過程中可能起著不同的作用[79]。由NPC水解磷脂生成的DAG在DGK的催化下生成PA。PA是重要的第二信使，在植物代謝調(diào)控過程中，與PA結(jié)合的調(diào)控蛋白和蛋白激酶的成員是最為重要的[80]。有研究表明，植物在受到干旱、鹽和ABA等非生物脅迫后，PA生成量均有所增加，而PA可由NPC水解磷脂獲得的DAG經(jīng)DGK催化獲得，由此可知，NPC能夠通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間接參與植物抵抗外界非生物脅迫的過程[75]。DGKs屬于保守的脂質(zhì)激酶，其主要作用是負(fù)責(zé)ATP介導(dǎo)的DAG磷酸化[79]。DGKs在真核生物中普遍存在，DGK的主要作用是調(diào)節(jié)DAG磷酸化為PA，從而將脂質(zhì)代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)連接起來[81]。然而，到目前為止，關(guān)于植物DGKs的功能和性質(zhì)依然不是很清楚。

在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，由DGK介導(dǎo)的DAG轉(zhuǎn)化為PA研究得較為清楚[6]。冷脅迫處理擬南芥細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，DGK是細(xì)胞中產(chǎn)生PA的主要原因[82]。與動(dòng)物信號(hào)系統(tǒng)類似，DGKs通常被認(rèn)為是DAG信號(hào)調(diào)節(jié)器而不是PA信號(hào)的調(diào)節(jié)器，植物中的DGK在調(diào)節(jié)DAG時(shí)可能具有非PA形成的胞內(nèi)互補(bǔ)功能，因此其在信號(hào)和脂類生物合成中都有作用[83]。研究表明，在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達(dá)水稻DGK基因OsBIDK1增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性[48]。使用DGK抑制劑R59022處理被真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的豌豆上胚軸組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)R59022處理能夠增加植物抗毒素的積累[84]。使用R59022處理擬南芥幼苗，發(fā)現(xiàn)能夠抑制幼苗根的伸長和生長[85]，由此可知，DGKs在植物的應(yīng)激反應(yīng)和發(fā)育過程中都發(fā)揮作用。雖然DAG主要由NPC水解PC而來，且PA被認(rèn)為是最重要的脂質(zhì)第二信使，但是DGKs確是協(xié)調(diào)兩者調(diào)控功能的主要因素。

4?展望

近年來隨著研究的深入，對(duì)植物NPC的研究越來越多，對(duì)其功能了解也越來越清楚，人們發(fā)現(xiàn)植物NPC在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起著至關(guān)重要的作用。然而，目前對(duì)于NPC的研究主要集中在模式植物擬南芥和水稻中，且研究相對(duì)較少。作為NPC的主要水解產(chǎn)物DAG，在動(dòng)物體內(nèi)已經(jīng)明確其為一種脂質(zhì)信使，但其在植物信號(hào)中的功能依然是一個(gè)未解之謎。最近的研究發(fā)現(xiàn)，DAG能夠直接參與植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而不需要轉(zhuǎn)化成PA，這將直接激起人們對(duì)DAG功能研究的興趣，這其中最大的挑戰(zhàn)是DAG下游靶物質(zhì)的鑒定。目前，關(guān)于NPC的基因結(jié)構(gòu)、生化特性、細(xì)胞定位及其生理功能的研究已經(jīng)取得了初步成效，后續(xù)的研究將主要針對(duì)其水解產(chǎn)物DAG在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用以及NPC的一些其他功能上。對(duì)NPC基因功能的深入研究將進(jìn)一步揭示植物生長發(fā)育以及抵抗不同外源脅迫后的生理反應(yīng)，不僅能夠填補(bǔ)NPC基因在這個(gè)領(lǐng)域的空白，也能夠?yàn)槔没蚬こ淌侄胃牧贾参锟鼓嫘蕴峁﹥?yōu)質(zhì)候選基因。

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