隱球菌腦膜炎患者腦脊液宏基因組二代測(cè)序結(jié)果分析

葛 瑛，范思遠(yuǎn)，陳健華，申 奧，竇洪濤，肖 盟，徐英春，宮燕萍， 任海濤，吳紅龍，關(guān)鴻志

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1感染內(nèi)科 2神經(jīng)科 4檢驗(yàn)科， 北京 1007303天津華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所， 天津 300308

隱球菌廣泛存在于自然界的土壤及鴿糞等鳥類排泄物中，屬條件致病菌，常累及肺、皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)。隱球菌有兩種主要血清型，新型隱球菌和格特隱球菌[1]，在中國新型隱球菌最常見[2]。隱球菌腦膜炎主要見于免疫功能低下人群，尤其是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者，也可發(fā)生于HIV陰性的器官移植或應(yīng)用激素免疫抑制劑治療的患者。全球每年新發(fā)隱球菌腦膜炎超過100萬例，死亡約60萬例/年[3]。近年有文獻(xiàn)報(bào)道免疫功能正常人群也可發(fā)生隱球菌腦膜炎[4]，一旦感染，死亡率接近20%[5]。因此，早診早治對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

由于臨床表現(xiàn)及腦脊液檢查結(jié)果缺乏特異性，目前對(duì)隱球菌腦膜炎，尤其是免疫功能正常患者的早期診斷，還存在相當(dāng)比例的漏診和誤診[6]。分子生物學(xué)檢測(cè)是近年興起的一種病原學(xué)檢測(cè)方法，可以提高傳統(tǒng)檢測(cè)方法的檢出率，關(guān)于腦脊液宏基因組測(cè)序用于臨床微生物檢測(cè)的研究報(bào)道逐漸增多[7- 11]。本文分析了腦脊液宏基因組二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術(shù)用于隱球菌腦膜炎診斷的病例，探討該技術(shù)對(duì)臨床診斷的潛在價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性收集北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科牽頭組織的腦炎多中心臨床登記研究數(shù)據(jù)庫中，2014年1月至2016年12月期間采用mNGS技術(shù)診斷的隱球菌腦膜炎患者臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床存在腦炎或腦膜炎癥狀及體征；(2)腦脊液常規(guī)、生化檢查異常，提示顱內(nèi)感染；(3)腦脊液mNGS 檢測(cè)出隱球菌，同時(shí)排除穿刺損傷引起的血液污染；(4)患者臨床特點(diǎn)、輔助檢查支持隱球菌腦膜炎，且抗真菌治療的效果與轉(zhuǎn)歸均符合mNGS診斷。需同時(shí)滿足上述4條標(biāo)準(zhǔn)。

本研究獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：JS- 890)。所有患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集

收集患者主要臨床表現(xiàn)、顱內(nèi)壓、腦脊液常規(guī)檢測(cè)、生化檢查、頭顱磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)檢查以及腦脊液涂片、墨汁染色、隱球菌抗原檢測(cè)等相關(guān)臨床資料。

1.3 宏基因組二代測(cè)序

在常規(guī)腰椎穿刺檢查時(shí)額外留取1 ml腦脊液，采集后立即-20 ℃凍存，保存在干冰中運(yùn)輸至天津華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行病原菌mNGS分析。

取300 μl腦脊液樣本，采用TIANampMicroDNA試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。提取的DNA經(jīng)超聲破碎至150～200 bp核酸，經(jīng)末端修復(fù)、接頭連接、PCR擴(kuò)增等步驟制備DNA文庫。使用安捷倫2100生物分析儀(加拿大安捷倫科技公司)質(zhì)控，使用QPCR定量文庫濃度。質(zhì)控合格的DNA文庫在BGISEQ- 100測(cè)序平臺(tái)(深圳華大集團(tuán))測(cè)序[12]。

獲取原始測(cè)序數(shù)據(jù)后，過濾低質(zhì)量和長度<35 bp的序列，應(yīng)用BWA軟件(http：//bio-bwa.sourceforge.net)比對(duì)人的參考序列，去除人源序列后，將剩余序列與微生物數(shù)據(jù)庫(包括細(xì)菌庫、真菌庫、病毒庫及寄生蟲庫)進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的注釋并自動(dòng)輸出檢測(cè)報(bào)告。

1.4 PCR鑒定

利用Primier軟件設(shè)計(jì)引物，新型隱球菌和格特隱球菌的上下游引物分別為CRG- 5F ACGATTGTGTC ACGTCGAGC和CRG- 5R TGCAGGTTTCCACCCTTTCC。對(duì)隱球菌特異片段進(jìn)行擴(kuò)增，隨后采用ABI3730xL型基因分析儀(美國賽默飛)測(cè)序，利用NCBI中BLAST數(shù)據(jù)庫分析測(cè)序序列。由于標(biāo)本量的限制，僅對(duì)3例樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 菌種鑒定

對(duì)mNGS分析提示格特隱球菌感染的樣本，采用電離飛行質(zhì)譜分析儀(MALDI-TOF MS，德國布魯克)同時(shí)對(duì)rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域(internal transcri-bed spacer，ITS)進(jìn)行測(cè)序、鑒定、確證[13]。

1.6 常規(guī)腦脊液真菌培養(yǎng)

取腦脊液標(biāo)本1～5 ml注入BDFX400需氧培養(yǎng)瓶(美國BD公司)，儀器自動(dòng)報(bào)警后分區(qū)劃線接種于沙氏培養(yǎng)基，分別置于35 ℃和25 ℃孵育箱中培養(yǎng)12～24 h，用YST 酵母菌生化鑒定卡對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定。

1.7 腦脊液墨汁染色

將腦脊液高速離心，棄上清，沉淀以5∶1比例與墨汁混勻鏡檢；或采用自然沉淀法，用侯氏腦脊液細(xì)胞學(xué)沉淀器制片，滴加1∶1稀釋的墨汁，加蓋玻片鏡檢。黑色背景下見到出芽或大小不均的菌體及透亮莢膜即可判斷為墨汁染色陽性。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

6例符合入選和排除標(biāo)準(zhǔn)的患者均來自中國北方地區(qū)，男性4例，女性2例，年齡26～53歲，中位年齡51歲。所有患者既往體健，HIV陰性，亞急性病程，最常見的臨床癥狀包括頭痛、發(fā)熱、惡心、嘔吐。2例患者出現(xiàn)復(fù)視，1例出現(xiàn)一過性意識(shí)喪失。

2.2 頭顱磁共振成像

6例患者均接受頭顱MRI檢查，其中1例在發(fā)病2個(gè)月后顯示雙側(cè)基底節(jié)區(qū)多發(fā)囊性病變(圖1A、1B)，發(fā)病12個(gè)月暨抗真菌治療11個(gè)月時(shí)，病變范圍擴(kuò)大(圖1C、1D)，繼續(xù)抗真菌治療8個(gè)月后顱內(nèi)病灶縮小(圖1E、1F)。其余5例患者頭顱MRI無異常表現(xiàn)。

圖 1 隱球菌腦膜炎患者的頭顱磁共振成像 左列為T1加權(quán)像，右列為T2加權(quán)像; A、B.發(fā)病2個(gè)月時(shí)，雙側(cè)基底節(jié)區(qū)顯示多發(fā)囊性病變；C、D.發(fā)病12個(gè)月、治療11個(gè)月后，雙側(cè)基底節(jié)區(qū)多發(fā)囊性病灶范圍擴(kuò)大；E、F.抗真菌治療8個(gè)月后，雙側(cè)基底節(jié)區(qū)多發(fā)囊性病灶縮小

2.3 腦脊液常規(guī)檢查

6例患者出現(xiàn)不同程度的顱內(nèi)壓升高及腦脊液細(xì)胞數(shù)增多，腦脊液中蛋白含量輕度升高，糖正?；蜉p度降低(表1)。5例患者腦脊液墨汁染色陽性(患者1～4和6，圖2)，4例隱球菌抗原檢測(cè)陽性(患者1～3和5)，2例真菌培養(yǎng)陽性。

2.4 療效觀察

抗真菌治療后，6例患者臨床癥狀改善，主要治療方案包括兩性霉素B 0.5～0.7 mg/(kg·d)聯(lián)合氟胞嘧啶100 mg/(kg·d)，序貫氟康唑400 mg/d單藥治療。

2.5 腦脊液二代測(cè)序及PCR驗(yàn)證結(jié)果

6例患者的腦脊液標(biāo)本均進(jìn)行了新型隱球菌及格特隱球菌的測(cè)序、鑒定(表1)。排除背景菌序列后，NGS檢測(cè)到所有隱球菌的核酸序列數(shù)為108～25 361，基因覆蓋率為0.19%～29.00%，檢測(cè)深度為1。其中患者2～6的新型隱球菌序列數(shù)明顯高于格特隱球菌，而患者1的格特隱球菌序列數(shù)則顯著高于新型隱球菌(圖3，4)。檢測(cè)結(jié)果顯示存在背景菌，包括痤瘡丙酸桿菌、根瘤菌屬、酸熱脂環(huán)酸桿菌等。

患者1、2、4經(jīng)PCR檢測(cè)證實(shí)為隱球菌感染(圖5)，患者1經(jīng)飛行質(zhì)譜分析儀鑒定驗(yàn)證為格特隱球菌感染。驗(yàn)證結(jié)果均符合mNGS的分析結(jié)果。

表 1 6例隱球菌腦膜炎患者腦脊液實(shí)驗(yàn)和mNGS檢測(cè)結(jié)果

mNGS：宏基因組二代測(cè)序；C-Ag：隱球菌抗原

圖 2 腦脊液墨汁染色可見大量隱球菌(自然沉淀法侯氏沉淀器制片，×200)

3 討論

本研究對(duì)臨床擬診隱球菌腦膜炎的患者同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)涂片、染色、培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和mNGS的方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，傳統(tǒng)腦脊液培養(yǎng)的陽性率較低，血清學(xué)檢查、墨汁染色及宏基因組mNGS的檢出率較高，且mNGS可檢出格特隱球菌血清型菌，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法無法進(jìn)行菌種鑒定的不足。

隱球菌為機(jī)會(huì)性致病菌，多見于免疫缺陷尤其是艾滋病患者，免疫功能正?；颊叩碾[球菌腦膜炎常出現(xiàn)漏診或誤診。隱球菌腦膜炎的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，部分患者并無明確的鴿子、鳥類接觸史，由于中國大部分地區(qū)結(jié)核患者相對(duì)多見，其腦脊液變化與隱球菌腦膜炎接近，故常誤診為結(jié)核性腦膜炎而延誤治療。因此，隱球菌腦膜炎早期確診和針對(duì)性治療至關(guān)重要。

圖 3格特隱球菌序列數(shù)高的隱球菌腦膜炎患者腦脊液宏基因二代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

A.核酸序列在格特隱球菌基因組的位置； B.序列分布圖

圖 4新型隱球菌序列數(shù)高的隱球菌腦膜炎患者腦脊液宏基因二代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

A.核酸序列在新型隱球菌基因組的位置； B.序列分布圖

圖 5 隱球菌腦膜炎患者腦脊液PCR驗(yàn)證結(jié)果A.患者1(泳道064)和患者2(泳道219- 2)，N為空白對(duì)照， M為Trans2K DNA Marker； B.患者4(泳道434)，N為空白對(duì)照，M為DL2000 DNA Marker

傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)將腦脊液置于沙堡培養(yǎng)基進(jìn)行孵育，通常需3～14 d，且不同實(shí)驗(yàn)室的敏感度差異很大，本研究中僅2例腦脊液培養(yǎng)陽性。近年隱球菌抗原側(cè)流式免疫層析法(CrAgLFA)和乳膠凝集或酶免疫測(cè)定法逐漸成為主要檢測(cè)方法，但這些方法無法鑒別潛伏感染和現(xiàn)癥活動(dòng)感染[14]，且不同試劑盒間的差異顯著。

本研究嘗試采用mNGS技術(shù)輔助隱球菌腦膜炎診斷，具備以下優(yōu)勢(shì)：(1)mNGS技術(shù)檢測(cè)速度較快，目前可在48 h內(nèi)得到結(jié)果，盡早診斷意味著患者有可能獲得更好的預(yù)后；(2)測(cè)序結(jié)果可提示患者存在現(xiàn)癥感染，對(duì)臨床醫(yī)生選擇治療方案具有重要意義；(3)由于mNGS是基于從無知到已知的篩查過程，?？稍谂R床表現(xiàn)不典型或缺乏相應(yīng)表現(xiàn)時(shí)提供有意義的診斷信息，如本研究中患者6就是在延誤診斷3個(gè)月后才通過mNGS確診；(4)mNGS可有效區(qū)分新型隱球菌和格特隱球菌，在中國，新型隱球菌及格魯比變種最常見，是國內(nèi)引起隱球菌腦膜炎的主要病原菌[2,15- 16]，格特隱球菌具有明顯的地域分布特點(diǎn)，熱帶地區(qū)多見，而在中國罕見，尤其是北方地區(qū)[17- 18]。由于我國流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示以新型隱球菌感染為主，故臨床一旦發(fā)現(xiàn)隱球菌感染的證據(jù)，均常規(guī)按新型隱球菌進(jìn)行治療。其實(shí)格特隱球菌與新型隱球菌感染在疾病進(jìn)展及治療策略方面存在顯著差異，在HIV陰性患者中格特隱球菌出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的比例較高，如腦組織多發(fā)性肉芽腫性損傷，對(duì)抗真菌藥物的反應(yīng)差，需進(jìn)行神經(jīng)外科手術(shù)干預(yù)的比例顯著高于新型隱球菌[1,19]。而目前通過常規(guī)微生物組織學(xué)和生化鑒定方法，包括墨汁染色、常規(guī)培養(yǎng)以及隱球菌抗原檢測(cè)等方式均無法對(duì)二者進(jìn)行鑒別。本研究的6例患者中，5例為新型隱球菌感染，1例為格特隱球菌感染，所有患者來自北方地區(qū)，提示我國北方地區(qū)格特隱球菌感染情況值得關(guān)注。

5例新型隱球菌腦膜炎患者的頭顱MRI未見異常，而格特隱球菌感染的1例患者則出現(xiàn)雙側(cè)基底節(jié)病變，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[20]。本研究提示，mNGS聯(lián)合腦脊液生化檢測(cè)可有效鑒別上述兩個(gè)不同菌種，隨著格特隱球菌病例數(shù)的積累，其臨床特點(diǎn)或許會(huì)逐漸清晰準(zhǔn)確。

由于本研究為單中心數(shù)據(jù)，病例數(shù)少，僅對(duì)部分病例進(jìn)行了腦脊液PCR驗(yàn)證，可能會(huì)對(duì)分析結(jié)果有一定影響。

腦脊液mNGS技術(shù)可準(zhǔn)確判斷隱球菌感染，并對(duì)鑒別格特隱球菌具有一定優(yōu)勢(shì)，有助于降低免疫功能正常人群隱球菌腦膜炎的漏診情況。病原體mNGS技術(shù)正處于快速臨床轉(zhuǎn)化階段，需要更多的研究和數(shù)據(jù)支持。結(jié)果判讀亦需臨床醫(yī)師密切結(jié)合患者病情綜合判斷，這是目前存在的普遍問題，需進(jìn)一步統(tǒng)一規(guī)范。雖然腦脊液mNGS技術(shù)快速精準(zhǔn)，但需結(jié)合成本費(fèi)用、適用的疑難/復(fù)雜病例選擇等問題綜合考慮。