八味傷科活血片提取工藝優(yōu)化及三七皂苷R1的HPLC含量測定

黃偉群，曾聰彥，胡玉良，辛?xí)苑迹苡?/p>

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東中山528400）

八味傷科活血片為廣東省中山市中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，處方以桃紅四物湯加減，方中三七、桃仁、紅花破血逐瘀，同為君藥；澤蘭、赤芍、當(dāng)歸增強君藥活血化瘀之力，共為臣藥；生地黃滋陰清熱，既清血瘀之熱毒，又祛瘀而不傷血，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥相伍，共奏活血祛瘀、通絡(luò)止痛之功效。目前該制劑在臨床上用于跌打損傷初期已取得良好效果［1］。本文選取干浸膏收得率與總黃酮含量為考察指標(biāo)，利用正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝，優(yōu)化八味傷科活血片的工藝條件；并建立三七皂苷R1的HPLC含量測定方法，為八味傷科活血片質(zhì)量控制提供方法學(xué)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

高效液相色譜儀（Agilent 1100系列）；Good See-I型薄層色譜攝影儀（上海科哲生化科技有限公司）；加強型玻璃點樣毛細管（華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn)）；IXUS115HS-Canon數(shù)碼相機（佳能（中國）有限公司）；KQ5200E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JA1203型電子天平（上海天平儀器廠）；BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；東方-A型直熱式電熱恒溫干燥箱（廣州東方電熱干燥設(shè)備廠）；UV2550紫外分光光度計（鄭州今邁衡器有限公司）；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；CRLB-1500S電爐（肇慶金雅樂電器有限公司）；JP-300A高速多功能粉碎機（永康市久品工貿(mào)有限公司）；800型離心機（上海手術(shù)機械廠）；TC-15套式恒溫器（浙江新華醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥與試劑

八味傷科活血片（中山市中醫(yī)院制劑室提供，3批次批號分別是:20160831，20161104，20170210）；所用藥材均為飲片，購自廣州康圣藥業(yè)有限公司。三七皂苷R1對照品（批號110745-200617），購自中國食品藥品檢定研究院。HPLC用甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 提取工藝優(yōu)化方法與結(jié)果

2.1 提取工藝

按1日處方量，分別稱取桃仁、地黃、紅花、澤蘭、赤芍、甘草，加熱回流提取，提取液紗布過濾，收集濾液，濃縮，定容至100 mL，得提取液。

2.2 干浸膏收得率測定方法

精密移取各提取液10 mL，平行3份，置已干燥至恒重的已知重量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，置于105℃的烘箱中，干燥3 h后，迅速移至干燥器中，待冷卻30 min后，精密稱定重量，記錄數(shù)據(jù)，計算平均值。

膏量（g），V為藥液總體積（mL），W1為藥材（除去三七、當(dāng)歸）的重量（g），V1為測定用藥液體積（mL）。

2.3 總黃酮含量測定方法的建立

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品0.006 1g，置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，得蘆丁對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密移取提取液1 mL，置5 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液稀釋至刻度線，搖勻，超聲30 min，離心5 min；精密吸取上層澄清溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻后靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻后靜置6 min；再加入4.3%氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，加入60%乙醇溶液稀釋至刻度線，搖勻。

2.3.3 最大吸收波長的測定 精密量取蘆丁對照品溶液10 mL，平行3份，置于25 mL容量瓶中，同“2.3.2 供試品溶液的制備”項下操作，制得 48.8 μg/mL對照品溶液。放置15 min，取適量溶液置于比色皿中，在波長400 nm～600 nm范圍內(nèi)測定最大吸收波長，計算平均值，結(jié)果蘆丁對照品溶液在509 nm處有最大吸收。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密移取蘆丁對照品溶液 2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置于 25 mL容量瓶中，同“2.3.2 供試品溶液的制備”項下操作，制得 9.76 μg/mL、19.52 μg/mL、29.28 μg/mL、39.04 μg/mL、48.8 μg/mL 對照品溶液。并以 60%乙醇溶液作為空白對照溶液，按照紫外-可見分光光度法進行操作，于509 nm波長處測定溶液的吸光度值。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=11.773X+0.000 5，R2=0.999 8。

2.4 提取工藝優(yōu)化

2.4.1 正交優(yōu)化 以干浸膏收得率和總黃酮含量為指標(biāo)，選擇浸泡時間、料液比例、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，選用L9（34）正交試驗表進行提取正交試驗。把黃酮含量的權(quán)衡系數(shù)定為0.6，干浸膏得率的權(quán)衡系數(shù)定為0.4。正交試驗方案與結(jié)果見表 1。綜合值（g）=總黃酮含量（g）×0.6+干浸膏得率×藥材體質(zhì)量（g）×0.4

表1 L9（34）正交試驗方案與結(jié)果

由表1可知，影響提取工藝的因素大小順序為 D＞B＞C＞A，即提取次數(shù)＞加水量＞提取時間＞浸泡時間；最佳提取方案為A3B3C2D3，即加10倍量的水浸泡1 h，加熱提取3次，每次1.5 h。表2數(shù)據(jù)表明，提取次數(shù) D3＞D2＞D1，D2與 D3差異較少，考慮生產(chǎn)成本，選擇D2提取2次；不同浸泡時間（因素A）對工藝影響最小，減少浸泡時間可提高生產(chǎn)效率。因此，最佳工藝為A1B3C2D2，即加入10倍量的水加熱提取2次，每次1.5 h。

2.4.2 工藝驗證 為了保證上述優(yōu)選工藝條件的重現(xiàn)性和可行性，取除三七、當(dāng)歸外的其余藥味飲片各3份，每份稱取1日處方量，置圓底燒瓶中，按照A1B3C2D2制備樣品溶液。分別精密量取提取液10 mL與1 mL，同“2.2干浸膏得率測定方法與結(jié)果”與“2.3總黃酮含量測定方法的建立”項下操作，制得供試品溶液，并測定干浸膏得率和總黃酮含量，求出RSD值，結(jié)果見表3。

表3數(shù)據(jù)表明，干浸膏得率的RSD為1.6%＜2.0%，總黃酮含量的RSD值為 3.9%＜4.0%，說明工藝穩(wěn)定可行，有效成分提出率高。

表2 L（934）正交試驗方差分析表

表3 驗證結(jié)果

3 三七皂苷R1含量的HPLC測定方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25℃；以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0 min:5%A～95%B；15 min:10%A～90%B；28 min:15%A～85%B）；流速 1.0 mL/min；檢測波長203 nm；進樣量20 μL。理論塔板數(shù)大于2000，分離度大于 1.5。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液 精密稱取三七皂苷R1對照品，置于5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得濃度為3.88 mg/mL三七皂苷R1對照品溶液。

3.2.2 供試品溶液 取八味傷科活血片適量，去包衣，研磨成粉，置于干燥潔凈的錐形瓶中，精密稱取50 mL的甲醇溶液，加入錐形瓶中，稱定并記錄重量，放置過夜，于80℃的水浴中加熱微沸2 h，放涼至室溫后稱重，并加甲醇溶液至原先稱定的重量后，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3 陰性溶液 按照八味傷科活血片的制備工藝，制成缺三七的陰性樣品，按照“3.2.2”項下操作，制成缺三七的陰性對照品溶液。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性 按3.1項下色譜條件，測定對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，分別進樣20 μL，記錄色譜圖。如圖1所示，在三七皂苷R1色譜峰位置上，陰性無干擾，表明本實驗的測定方法專屬性好。

圖1 八味傷科活血片HPLC圖

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取“3.2.1”項下的對照品溶液適量，制成 0.388 mg/mL、0.776 mg/mL、0.970 mg/mL、1.940 mg/mL、3.880 mg/mL 的不同濃度對照品溶液。按照3.1項下色譜條件，分別進樣20 μL。以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，回歸方程為Y=3172X+3513，R2=0.999 8，表明三七皂苷 R1在 0.388 mg/mL～3.880 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液（3.880 mg/mL）20 μL，連續(xù)進樣 6 次，測定峰面積。峰面積RSD=0.03%，表明儀器精密度良好。

3.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批次（批號:20161104）樣品，精密稱取 8 份，按“3.2.2”項下方法制備供試液，依法測定供試品溶液中三七皂苷R1的峰面積。結(jié)果峰面積RSD=0.05%。說明方法重現(xiàn)性良好。

3.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一份供試品溶液6份，分別于 0 h，2 h，4 h，6 h，10 h，22 h，26 h和 32 h進樣，結(jié)果三七皂苷R1峰面積RSD為0.03%，表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的八味傷科活血片（批號 20161104）約 2.0 g，共 6 份，精密稱定。分別精密加入三七皂苷R1對照品0.011 7 mg，按“3.2.2”項下方法制備供試液，按“3.1”項下色譜條件測定含量，計算加樣回收率。加樣回收率為93.16%，RSD=1.2%，表明三七皂苷 R1的加樣回收試驗良好，符合定量分析要求。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗

3.3.7 樣品含量測定 取八味傷科活血片3批（批號 20160831，20161104，20170210），按“3.2.2”項下方法制備供試液，依法測定，計算供試品中三七皂苷R1的含量，結(jié)果見表5。

表5 含量測定結(jié)果

4 討 論

八味傷科活血片可改善臨床髖部周圍骨折患者的血液循環(huán)，消除其肢體腫脹。方中選用生三七為君藥，具止血活血、強心定痛、消腫散瘀功效［2］，藥理活性表現(xiàn)為抗炎、止血、抗衰老等［3］，主要活性成分為三七皂苷［3］，如三七皂苷 R1、人參皂苷Rg1、Rb1［4］。三七為貴細藥物，故將其打粉入藥，保證其充分利用，并建立HPLC對成品中三七皂苷R1進行質(zhì)量監(jiān)控，保證不同批次的八味傷科活血片中三七含量的穩(wěn)定性。

八味傷科活血片原工藝重現(xiàn)性較差，僅以浸出物為質(zhì)控指標(biāo)。八味傷科活血片方中桃仁、紅花、澤蘭主要含黃酮類成分［5-6］，所以本實驗紫外分光光度法測定總黃酮含量，并結(jié)合干浸膏收得率，共為工藝優(yōu)化考察指標(biāo)。通過正交試驗篩選提取工藝，優(yōu)化的工藝條件重現(xiàn)性好，質(zhì)控性強，最佳工藝為10倍量的水加熱提取2次，每次1.5 h。實驗中未對正交試驗4因素進行單因素考察，考慮到實際生產(chǎn)情況，為節(jié)約時間和經(jīng)濟成本，優(yōu)選工藝中省去了浸泡時間。