參靈口服液的研制及其提高免疫力作用的研究

秦 楠，王小敏，郭麗麗，劉雅儷，張朔生

（山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院，山西晉中030619）

參靈口服液是采用具有提高免疫功能的藥食同源植物和保健食品原料三七、西洋參、靈芝、甘草、黃芪、枸杞、梅花鹿茸，開(kāi)發(fā)的一種具有提高機(jī)體免疫力作用的口服液。其中，西洋參、靈芝與黃芪為我國(guó)衛(wèi)生部2018年新增藥食同源原料。三七，又名金不換，為五加科多年生草本植物，主要有效成分為三七皂苷，具有止血散瘀、消腫定痛的功效［1］。西洋參屬人參的一種，是補(bǔ)氣首選藥，含有多種人參皂苷、揮發(fā)油、糖類(lèi)、氨基酸和無(wú)機(jī)元素等，能夠抗缺氧、抗疲勞，增強(qiáng)機(jī)體的適應(yīng)能力和免疫力［2-3］。趙珺彥等［4］以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)西洋參提取物對(duì)其有增強(qiáng)免疫力的作用。靈芝主要含有三萜類(lèi)化合物、多糖類(lèi)、核苷類(lèi)、生物堿類(lèi)、氨基酸多肽類(lèi)、無(wú)機(jī)元素、脂肪酸等，其中，多糖作為主要生物活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等作用［5］。枸杞中富含的多糖是枸杞中最主要的活性成分，具有抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、保肝、促進(jìn)免疫等作用［6］。黃芪主要成分為苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖、氨基酸等，側(cè)重補(bǔ)虛，具有固表、保肝利尿、降壓抗菌、抗衰老、抗應(yīng)激、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用［7］。Cho WCS等［8］發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能恢復(fù)高齡小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞增生反應(yīng)，從而表現(xiàn)出免疫恢復(fù)作用。鹿茸是雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，富含豐富的氨基酸、多肽類(lèi)、糖類(lèi)、維生素、微量元素和甾類(lèi)化合物等。鹿茸多糖（PAPS）作為鹿茸的主要活性成分，具有調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、保護(hù)肝損傷及抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等多種生物活性［9-11］。甘草氣微，味甜而特殊，主要成分有甘草酸、甘草苷等，作為甘草中最重要的生理活性物質(zhì)，具有保肝降酶、抗菌、抗病毒抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用［12-14］。

本實(shí)驗(yàn)將上述中藥材利用超聲提取得到總皂苷和總多糖，將兩者進(jìn)行科學(xué)配伍并添加輔料，通過(guò)正交試驗(yàn)方法研制出參靈口服液，并對(duì)口服液提高機(jī)體免疫力作用進(jìn)行了初步探討，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試藥與試劑 三七、西洋參、靈芝、甘草、黃芪、枸杞、馬鹿茸購(gòu)自亳州。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海士鋒生物科技有限公司）；無(wú)水乙醇、NaOH、A（lNO3）3、濃硫酸、苯酚、石油醚、正丁醇、苯甲酸鈉、純化水。

1.1.2 動(dòng)物與儀器 清潔級(jí)昆明種小鼠（14～18 g）40只，雌雄兼用，實(shí)驗(yàn)前小鼠在動(dòng)物房適應(yīng)3 d。AR423CN電子天平，奧豪斯儀器有限公司；HH-2數(shù)據(jù)恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；DZTW電子調(diào)溫電熱套，天津市工業(yè)電器廠；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RRHP-100型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)，歐凱萊芙（香港）寶業(yè)公司；KQ-100E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TGL-20B飛鴿牌系列離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵，鞏義市子華有限責(zé)任公司；UItra-3660紫外分光光度儀，北京普源精電科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 參靈口服液的制備

1.2.1.1 工藝流程 靈芝、馬鹿茸、枸杞、黃芪、甘草磨粉→過(guò)篩→石油醚浸泡→超聲提取→sevage除蛋白→醇沉→濃縮→總多糖（A）；三七、西洋參磨粉→過(guò)篩→乙醇浸泡→超聲提取→石油醚、正丁醇萃取→濃縮→總皂苷干膏（B）；A、B混合→調(diào)配→均質(zhì)（木糖醇、蜂蜜、檸檬酸、穩(wěn)定劑）→脫氣→殺菌→冷卻→成品→灌裝。

1.2.1.2 總多糖與總皂苷提取率的測(cè)定 提取率=（濃度×體積）/藥粉體質(zhì)量×100%。

1.2.1.3 多糖皂苷溶液澄清處理 將多糖與皂苷干膏1∶1混合，加水調(diào)節(jié)至料液比 1∶20，備用。澄清劑法:在多糖皂苷溶液中加入1%的殼聚糖澄清劑（以1%的醋酸作為溶劑配制而成）靜置24 h［15］，取上清液，加入 0.2%的苯甲酸鈉，調(diào)節(jié) pH 至4.5，備用。離心分離法［16］:多糖皂苷溶液離心15 min，5000 r/min，取上清液，加入 0.2%的苯甲酸鈉，調(diào)節(jié) pH 至 4.5，備用。沉降分離法［16］:多糖皂苷溶液在冰箱冷藏靜置24 h，取清液，加入0.2%的苯甲酸鈉，調(diào)節(jié) pH 至 4.5，備用。

將所得的3種液體灌裝滅菌，避光放置15 d，觀察沉淀情況及澄明度，同時(shí)進(jìn)行多糖含量的檢測(cè)，結(jié)合多糖損失率確定最佳澄清工藝。

1.2.1.4 口服液復(fù)配實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)挑選20名食品專(zhuān)業(yè)同學(xué)對(duì)參靈口服液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，選用料液比（多糖皂苷與水）、木糖醇、蜂蜜及檸檬酸4個(gè)因素，進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)，篩選參靈口服液配方。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

1.2.1.5 感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)價(jià)小組共20人，以口感、外觀、氣味作為評(píng)定指標(biāo)，采用百分制對(duì)產(chǎn)品感官質(zhì)量進(jìn)行評(píng)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1.6 理化指標(biāo)檢測(cè) 相對(duì)密度、pH:分別采用相對(duì)密度測(cè)定法-比重瓶法及pH測(cè)定法?？偺?用苯酚-硫酸法測(cè)定［17］?？傇碥蘸?以三七皂苷R1標(biāo)準(zhǔn)品采用比色法進(jìn)行測(cè)定［18］?？傸S酮:擬采用《中國(guó)藥典》2015版一部附錄“紫外-可見(jiàn)分光光度法”對(duì)3批口服液總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定［19-20］。

1.2.2 參靈口服液提高機(jī)體免疫力實(shí)驗(yàn)［21-23］

1.2.2.1 對(duì)免疫器官指數(shù)的影響 取小鼠 40只，隨機(jī)分為4組。治療組分別給予低（0.2 mL/10 g）、中（0.3 mL/10 g）、高劑量（0.4 mL/10 g）參靈口服液；空白對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。灌胃1次/d，連續(xù)灌胃10 d，于末次灌胃后次日，處死小鼠，稱(chēng)體重，取脾臟、胸腺、肝臟稱(chēng)濕重，以胸腺或脾臟的體質(zhì)量（mg）與小鼠體質(zhì)量（g）之比作為胸腺或脾指數(shù)。

1.2.2.2 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 各組小鼠無(wú)菌取脾，制脾細(xì)胞懸液，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整脾細(xì)胞濃度為3×109個(gè)/L，按照MTT法進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，最后在752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)570 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度值（A），計(jì)算ConA+與ConA-各孔的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2003、SAS 8.0和Design-Expert（version8.0.6）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，應(yīng)用最小差異顯著法（LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 澄清工藝的選擇

經(jīng)過(guò)15 d的避光靜置，3種不同方法的澄清結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 澄清方法及結(jié)果分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，澄清劑法對(duì)多糖等有效成分有較強(qiáng)的吸附作用，損失較大，離心法對(duì)某些有效成分有所損失，所以試驗(yàn)選擇沉降分離法。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響程度的主次關(guān)系是A＞D＞B＞C，說(shuō)明影響口服液口感的主要因素是料液比，其次是檸檬酸，木糖醇和蜂蜜次之。正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果顯示，最佳工藝配方組合為A3B3C2D2，即料液比 1∶20，木糖醇 1.4 g，蜂蜜 1.0 g，檸檬酸0.04 g。在此工藝基礎(chǔ)上制備的參靈口服液色澤棕褐色，澄清透明，色澤均勻，無(wú)明顯雜質(zhì)沉淀，酸甜適口。相對(duì)密度 1.17（≥1.16）符合口服液標(biāo)準(zhǔn)，pH5.5，總糖 14.20%～14.25%，總皂苷 1.21%～1.34%，總黃酮 1.12%～1.14%。結(jié)果見(jiàn)表 4～表 5。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表5 方差分析

2.3 口服液對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，不同給藥組（低、中、高劑量）胸腺指數(shù)、脾指數(shù)及ConA+與ConA-差值明顯提高（P＜0.05，P＜0.01）。說(shuō)明參靈口服液能促進(jìn) ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。結(jié)果見(jiàn)表6～表7。

表6 口服液對(duì)免疫器官指數(shù)的影響 （±s）

表6 口服液對(duì)免疫器官指數(shù)的影響 （±s）

注:與空白對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 n胸腺指數(shù) 脾指數(shù)空白對(duì)照組 104.01±1.23 3.65±1.02低劑量組 104.44±0.891） 4.95±1.351）中劑量組 104.56±1.581） 5.02±0.861）高劑量組 104.79±0.931） 5.14±1.352）

表7 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果 （±s）

表7 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果 （±s）

注:與空白對(duì)照組比較，1）P＜0.05

組別 n空白對(duì)照組 10低劑量組 10中劑量組 10高劑量組 10 ConA+與 ConA-差值0.113±0.008 0.139±0.0051）0.138±0.0061）0.145±0.0091）

3 結(jié) 論

參靈口服液的最佳配方為料液比1∶20，木糖醇1.4 g，蜂蜜 1.0 g，檸檬酸 0.04 g。色澤棕褐色，澄清透明，酸甜適口。各理化指標(biāo)均符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。參靈口服液能夠提高免疫器官指數(shù)和促進(jìn)ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有良好的提高機(jī)體免疫力的作用。