RANKL/RANK/OPG信號通路參與調(diào)控磷酸三鈣磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的研究

賀志強(qiáng)，楊亞帆，陳先州，劉乃澄，余勤武*

(1.仙桃市第一人民醫(yī)院骨外一科，湖北 仙桃 433000；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215006)

關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療關(guān)節(jié)損傷疾病的最重要手段，但假體周圍骨溶解導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)仍是關(guān)節(jié)置換術(shù)后最常見的并發(fā)癥[1-2]。植入物釋放的聚乙烯、磷酸三鈣等特殊磨損顆粒通過刺激巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)種植體周圍顆粒狀炎癥，從而導(dǎo)致骨裂發(fā)生和隨后的骨溶解[3-4]。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、NF-kappa B的受體激活因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)和RANK配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)在破骨細(xì)胞的生理和病理發(fā)育過程中均發(fā)揮著重要作用[5]。RANKL與RANK結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞活化[6]。OPG與RANK競爭RANKL，從而抑制破骨細(xì)胞生成和骨吸收[7]。研究表明，外源性O(shè)PG可以阻斷大鼠卵巢切除相關(guān)的骨質(zhì)流失，提示其對骨質(zhì)疏松癥等發(fā)生系統(tǒng)性骨質(zhì)流失的疾病有重要作用[8]。然而OPG在局部病理性骨丟失中的作用還需要進(jìn)一步研究。因此，本研究采用磷酸三鈣磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，檢測OPG對假體周圍骨溶解的影響，探討RANKL/RANK/OPG信號通路在假體周圍骨溶解中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 昆明種小鼠(蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2017-0011)；磷酸三鈣磨損顆粒(浙江大學(xué)化學(xué)系)；OPG(美國Sigma公司)；3%戊巴比妥(購于上海上藥新亞藥業(yè)有限公司)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司，中國)、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司，中國)、PCR引物序列(大連TaKaRa公司，中國)：RANKL上游引物為5’-CACTATTAATGCCACCGAC-3’、下游引物為5’-GGGTATGAGAACTTGGGATT-3’；RANK上游引物為5’-ATGCGGTTTGCAGTTCTTCTC-3’、下游引物為5’-ACTCCTTATCTCCACTTAGG-3’；OPG引物序列：上游引物為5’-GCTTGAAACATAGGAGCTG-3’、下游引物為：5’-GTTTACTTTGGTGCCAGG-3’；GAPDH引物序列：上游引物為5’-CAGAACATCATCCCTGCCTCT-3’下游引物為：5-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3’；電子天平(上海梅特勒公司，中國)；組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備(德國Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；HBS-1096B酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及造模 選取雄性6周齡小鼠30只，體重18～22 g，在SPF級的環(huán)境中飼養(yǎng)，動(dòng)物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對小鼠進(jìn)行編號，用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和OPG組，每組10只。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg體重)進(jìn)行麻醉，剔除小鼠頭頂毛發(fā)，進(jìn)行消毒，沿顱頂正中矢狀切口(10 mm左右)，分離皮下組織，暴露顱骨(大小約1 cm×1 cm)。假手術(shù)組在無任何進(jìn)一步干預(yù)的情況下關(guān)閉切口。模型組和OPG組取30 mg磷酸三鈣磨損顆粒置于顱頂后關(guān)閉切口。OPG組于術(shù)后第2天在顱頂局部注射OPG(3 mg/kg)，每隔2天1次；假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，共2周。處死小鼠后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 HE染色觀察破骨細(xì)胞 分離顱骨，進(jìn)行甲醛固定48 h，用microCT掃描選顱骨相同位置的感興趣區(qū)域)進(jìn)行三維重建；用10%鹽酸進(jìn)行脫鈣，經(jīng)脫水、包埋，切成厚度為3 μm切片，進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察病理變化。選出一個(gè)具有代表性的圖像。用Image Pro-Plus 5.0計(jì)算矢狀縫區(qū)域3核及以上破骨細(xì)胞數(shù)。

1.4 TRAP染色觀察骨溶解 顱骨進(jìn)行病理切片后，經(jīng)脫蠟和乙醇梯度脫水后自然晾干，加入TRAP染色1h，雙蒸水清洗后置于顯微鏡下觀察小鼠顱骨溶解情況，用UTHSCA Image Tool測定骨溶解面積。

1.5 ELISA法檢測顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 每組隨機(jī)取3只小鼠顱骨骨膜組織，剪碎后用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，12 000 r/min離心15 min后收集上清，按照ELISA試劑盒的操作說明書進(jìn)行上述炎癥因子的檢測。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測顱骨中RANKL、RANK和OPG mRNA的水平 每組隨機(jī)取3只小鼠顱骨組織，剪碎后在液氮作用下充分研磨后加入Trizol 1 mL，根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書，加入氯仿、無水乙醇等試劑提取RNA，根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在37℃ 60 min，95℃ 5 min的逆轉(zhuǎn)錄條件下合成cDNA，將cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?；根?jù)熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)加熱15 min，一個(gè)循環(huán)；94℃ 15 s，65℃ 30 s，72℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測對其表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果分析，以GADPH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠假體周圍破骨細(xì)胞形成和骨溶解的變化情況 與假手術(shù)組比較，模型組和OPG組小鼠顱骨破骨細(xì)胞數(shù)和骨溶解面積均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，OPG組小鼠顱骨破骨細(xì)胞數(shù)和骨溶解面積均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1，見圖1～3)。

表1 三組小鼠假體周圍破骨細(xì)胞形成和骨溶解的變化情況

a 假手術(shù)組 b 模型組 c OPG組

a 假手術(shù)組

b 模型組

c OPG組

a 假手術(shù)組

b 模型組

c OPG組

2.2 三組小鼠顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的變化情況 與假手術(shù)組比較，模型組和OPG組小鼠顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，OPG組小鼠顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 三組小鼠顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的變化情況

2.3 三組小鼠顱骨中RANKL、RANK和OPG mRNA水平的變化情況 與假手術(shù)組比較，模型組和OPG組小鼠顱骨中RANKL、RANK、OPG mRNA的相對表達(dá)量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，OPG組小鼠顱骨中RANKL、RANK、OPG mRNA的相對表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表3 三組小鼠顱骨中RANKL、RANK和OPG mRNA水平的變化情況

3 討 論

關(guān)節(jié)置換術(shù)中植入物長期失效的主要原因是關(guān)節(jié)面誘導(dǎo)的骨溶解導(dǎo)致無菌性松動(dòng)[9]。破骨細(xì)胞形成關(guān)鍵介質(zhì)(RANKL、RANK、OPG)的失衡與此過程有關(guān)[10]。本研究證明外源性O(shè)PG可以有效預(yù)防和治療磷酸三鈣磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。

磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的小鼠模型是基于磨損顆粒和碎片[11]。本研究使用磷酸三鈣磨損顆粒，因?yàn)槠涫桥R床實(shí)踐中最常見和與生物相關(guān)的磨損碎片來源之一，我們希望更真實(shí)地模擬臨床場景。在本研究中，模型組破骨細(xì)胞生成和骨吸收增強(qiáng)，遠(yuǎn)高于假手術(shù)組水平。外源性O(shè)PG的加入顯著抵消了磨損顆粒的不良相關(guān)效應(yīng)，提示OPG治療可有效抑制顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和骨吸收。

破骨前細(xì)胞需要表達(dá)RANK才能發(fā)育成成熟的破骨細(xì)胞，而表達(dá)RANK mRNA的細(xì)胞確實(shí)是從含有顆粒的翻修組織中分離出來的[12]。翻修組織中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞可能是破骨細(xì)胞的前體，因?yàn)閬碜圆煌M織的這個(gè)譜系的細(xì)胞可以在成骨細(xì)胞或溶血細(xì)胞存在的情況下分化為破骨細(xì)胞[13]。顆粒刺激單核細(xì)胞在體外表達(dá)RANK和RANKL，在體內(nèi)表達(dá)巨噬細(xì)胞修飾組織，提示這些分子可能在關(guān)節(jié)周組織破骨細(xì)胞的產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用[14]。雖然RANKL在關(guān)節(jié)周的水平可能是決定破骨形成的關(guān)鍵，但OPG的水平也很重要。眾所周知，OPG在破骨細(xì)胞前參與RANKL與其受體(RANK)結(jié)合的競爭[15]。由于RANKL/OPG比值失衡與假體周圍骨溶解伴無菌性松動(dòng)密切相關(guān)，因此基因治療可能是一種潛在的治療策略[16]。RANKL/OPG比值被認(rèn)為是調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵參數(shù)，與多種骨代謝異常和骨紊亂相關(guān)。在以前的研究中，磨屑被證明能增加小鼠的RANKL和RANK水平[17]。如果提高OPG水平，那么RANKL的破骨作用將會(huì)減弱。同時(shí)，磨損顆?？杉せ畹木奘杉?xì)胞釋放TNF-α、IL-6和IL-1β等多種促炎細(xì)胞因子釋放[18]。這些炎癥因子的高水平表達(dá)可以通過其他信號通路激活成骨細(xì)胞的分化和成熟，誘導(dǎo)骨溶解，從而導(dǎo)致局部OPG表達(dá)的選擇性升高。然而，與假手術(shù)組相比，模型組中RANKL表達(dá)上調(diào)更為明顯，導(dǎo)致界面膜中RANKL/OPG比值顯著升高。給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位的活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)的特異性阻斷劑4-苯基丁酸能顯著減少小鼠假體周圍骨膜中IL-6、IL-1β、TNF-α和RANKL的產(chǎn)生，抑制骨溶解[19]。我們的研究也得出相似的結(jié)論。

綜上所述，通過給予外源性O(shè)PG能顯著抑制磷酸三鈣磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解，為關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)治療提供了理論依據(jù)，可作為假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)新的干預(yù)和治療靶點(diǎn)，最終提高置換關(guān)節(jié)的壽命。