不同濃度鹽堿脅迫對(duì)異育銀鯽的慢性損傷效應(yīng)

王龍濤,葛晨霞,高春山,于 鵬,盧怡婷,張 蕾,王建軍,李月紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春130118;2.長春科技學(xué)院職業(yè)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春 130600;3.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院,吉林 長春 130033;4.北京鼎九信息工程研究院有限公司,北京 房山 102488)

中國內(nèi)陸鹽堿水資源豐富,其中西北、東北及華北等內(nèi)陸地區(qū)有較多的高鹽堿化湖泊、泡沼等水域,此類水域的水質(zhì)具有高鹽堿、高pH 值、離子系數(shù)高、離子比例失調(diào)等特點(diǎn)[1]。我國是鹽堿水資源較多的國家,且逐年上升,發(fā)展以漁業(yè)利用為基礎(chǔ)的鹽堿水漁業(yè),對(duì)于緩解水資源危機(jī)和改善惡劣鹽堿水土生態(tài)環(huán)境也具有重要意義[2]。水域鹽堿濃度的變化與魚類的生存及生長息息相關(guān),普通淡水類魚蝦難以適應(yīng)高鹽堿水域環(huán)境,鹽堿度的變化可直接影響魚類機(jī)體血液、血清各項(xiàng)生理生化指標(biāo)變化或產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),過高的鹽堿濃度會(huì)對(duì)其機(jī)體造成不可逆的損傷。

異育銀鯽(Carassius auratus gibelio),異育銀鯽屬輻鰭魚綱,鯉形目,鯉科鯽屬是以方正銀鯽為母本,興國紅鯉為父本人工授精后的雌核發(fā)育子代,是我國鯽養(yǎng)殖中的主要品種[3]。本試驗(yàn)選用異育銀鯽為研究對(duì)象,由于它食性廣、生長快、病害少等特點(diǎn),有取代鯉魚成為我國非濾食魚類中第二大淡水養(yǎng)殖魚類的趨勢(shì)[4]。由于其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng),目前在廣大鹽堿地區(qū)和海邊灘涂池塘中也開始進(jìn)行規(guī)?；B(yǎng)殖[5]。

近年來,鹽堿水域養(yǎng)殖技術(shù)也已取得較大發(fā)展[6],但有關(guān)鹽堿度變化對(duì)水生生物機(jī)體脅迫所造成的損傷研究報(bào)道還較少。因此,本文通過設(shè)置不同濃度梯度的鹽堿聯(lián)合脅迫試驗(yàn),探討鹽堿水質(zhì)對(duì)異育銀鯽的慢性損傷效應(yīng),以期為開展鹽堿水域養(yǎng)殖魚類方面提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 所用藥品 碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鈉(NaCl),購自北京化工廠有限公司,試劑為分析純(AR 級(jí));超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒,均購自北京恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 鹽堿脅迫試驗(yàn) 試驗(yàn)所用健康異育銀鯽120 尾,體重為(29±2)g,由長春市新立城水庫提供。采用室內(nèi)循環(huán)水設(shè)備進(jìn)行飼養(yǎng),水溫維持在(25±2)℃,pH 值為7.2～7.4,氨氮含量為0.4～0.5 mg/L,溶氧水平5～7 mg/L。經(jīng)2 周的馴化飼養(yǎng)后,隨機(jī)選取健康、個(gè)體大小均勻的鯽魚進(jìn)行分組試驗(yàn),為空白對(duì)照Ⅰ組和鹽堿脅迫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組,設(shè)置NaCl 濃度梯度為0、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L(分別稱0、3.51 g、7.01 g、10.52 g NaCl溶于裝有60 L 水的水族缸中);NaHCO3濃度梯度0、15 mmol/L、30 mmol/L、45 mmol/L(分別稱0、75.6 g、151.2 g、226.8 g NaHCO3溶于裝有60 L 水的水族缸中),每組3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10 尾魚。試驗(yàn)期間鹽堿脅迫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組水體pH 值分別為8.8±0.2、9.5±0.3、10.4±0.2;氨氮含量分別為(0.7±0.1)mg/L、(0.9±0.2)mg/L、(1.2±0.1)mg/L。試驗(yàn)為期6 周,期間每3 d 定時(shí)換水,空白對(duì)照組換水量約為50%,鹽堿脅迫組換水量約為70%。

1.3 樣品處理 采用尾椎靜脈取血方式采集各組鯽魚血液,分裝于無菌抗凝管及促凝管中,4 ℃暫時(shí)保存。在冰盤上剖檢魚收集組織,無菌生理鹽水清洗后用濾紙吸干置于無菌EP 管中-80 ℃保存。

1.3.1 血液及血清生理生化指標(biāo)測(cè)定 采用BayerDVIA 120 型血細(xì)胞分析儀測(cè)定白細(xì)胞、紅細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均體積、血紅蛋白、平均血紅蛋白濃度、血小板。采用貝克曼(ProCX4)全自動(dòng)生化分析儀器測(cè)定谷丙尿素氮(UREA)、血糖(GLU)、堿性磷酸酶(AKP)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、肌酐(CREA)、白蛋白(ALB)水平。

1.3.2 組織中抗氧化酶的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量后按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水,剪碎組織并在冰水浴條件下制備勻漿,2 500～3 000 r/min 離心10 min,吸取上清待用。SOD 及CAT 活性測(cè)定的具體操作均按南京建成生物工程公司試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析 試驗(yàn)魚存活率和增重率的計(jì)算方法如下：存活率=存活尾數(shù)/總尾數(shù)×100;增重率=(Mt-Mo)/Mo×100;Mt 為試驗(yàn)?zāi)~體質(zhì)量,Mo 為試驗(yàn)初魚體質(zhì)量。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用IBM SPSS Statistics 20 軟件Tukey 單因素分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 異育銀鯽存活率及增重率 表1 為各組異育銀鯽存活率及增重率結(jié)果。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組增重率均顯著低于Ⅰ組(P＜0.05),其中Ⅳ組為負(fù)增重率。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組存活率均為100%,Ⅳ組存活率為70%。

表1 異育銀鯽存活率及增重率

2.2 異育銀鯽血液生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 表2 為異育銀鯽血液各生理指標(biāo)的測(cè)定值。相比于Ⅰ組,Ⅱ組白細(xì)胞及血小板數(shù)均顯著提高(P＜0.05),Ⅲ、Ⅳ組白細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.05),Ⅲ組血小板數(shù)降低不顯著(P＞0.05),Ⅳ組血小板數(shù)顯著降低(P＜0.05),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組紅細(xì)胞平均體積均顯著降低(P＜0.05),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組血紅蛋白顯著提高(P＜0.05),Ⅱ、Ⅳ組紅細(xì)胞數(shù)顯著提高(P＜0.05),Ⅲ組紅細(xì)胞數(shù)提高不顯著(P＞0.05),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組紅細(xì)胞壓積、平均血紅蛋白濃度均顯著提高(P＜0.05)。

表2 異育銀鯽血液生理指標(biāo)測(cè)定值

2.3 異育銀鯽血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 表3 為異育銀鯽血清各生化指標(biāo)的測(cè)定值。相比于Ⅰ組,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組ALT、AST 活性均顯著提高(P＜0.05),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組UREA、GLU、AKP、LDH、TP、ALB 水平均有不同程度提高,其中Ⅱ組UREA、GLU 水平差異不顯著(P＞0.05);相比于Ⅰ組,Ⅱ組CREA 水平顯著降低(P＜0.05),Ⅲ組CREA 水平降低不顯著(P＞0.05),Ⅳ組CREA 水平顯著提高(P＜0.05)。

表3 異育銀鯽血清生化指標(biāo)測(cè)定值

2.4 異育銀鯽肝胰臟SOD 及CAT 活性測(cè)定結(jié)果各處理組異育銀鯽肝胰臟SOD 及CAT 活性[7]變化如下圖1 所示,與對(duì)照組相比,Ⅱ組SOD 及CAT活性均顯著升高(P＜0.05),Ⅲ、Ⅳ組SOD 及CAT活性均顯著降低(P＜0.05)。

圖1 大腸桿菌生物膜的篩選結(jié)果

3 討論

3.1 鹽堿脅迫對(duì)異育銀鯽血液生理指標(biāo)的影響水體鹽度能夠影響魚類滲透調(diào)節(jié)功能,導(dǎo)致魚類機(jī)體組織失水、代謝能力下降。堿度對(duì)魚類的損傷效應(yīng)屬于綜合致毒效應(yīng),堿濃度的變化主要導(dǎo)致魚類產(chǎn)應(yīng)激反應(yīng),影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[8]。研究結(jié)果表明,在高鹽、高堿條件下泌氯細(xì)胞調(diào)節(jié)滲透壓耗能較多,導(dǎo)致生長性能減慢,從而影響了幼魚的生長[8]。通過測(cè)定血液生理指標(biāo)的變化來評(píng)估魚類機(jī)體的新陳代謝能力和生理健康水平已被廣泛應(yīng)用[9]。本試驗(yàn)中,鹽堿脅迫組異育銀鯽紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白濃度及平均血紅蛋白濃度均高于對(duì)照組,這可能是由于鹽堿脅迫,機(jī)體做出的適應(yīng)性反應(yīng)而引起應(yīng)激的產(chǎn)生。張玉等[10]研究發(fā)現(xiàn),鹽堿水域魚類機(jī)體與滲透壓調(diào)節(jié)有關(guān)的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積等指標(biāo)均顯著高于淡水水域中的魚類,與本試驗(yàn)結(jié)果相似。而白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)隨著水體鹽堿濃度的升高表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì),說明高濃度的鹽堿水環(huán)境對(duì)異育銀鯽機(jī)體造成一定程度的損傷。

3.2 鹽堿脅迫對(duì)異育銀鯽血清生化指標(biāo)的影響血清生化指標(biāo)的變化可從側(cè)面反映魚類機(jī)體新陳代謝的狀況[11]。CREA 水平用于診斷腎功能狀況,其水平的增高多見于各種原因而引起的腎小球?yàn)V過功能的減退。最高濃度鹽堿脅迫組的CREA 水平顯著升高表明異育銀鯽腎功能受損。與對(duì)照組相比,鹽堿脅迫組血清GLU 水平均顯著升高,其中Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組相比差異性顯著,表明異育銀鯽組織細(xì)胞的代謝能力下降。蛋白質(zhì)作為血清中重要的組成成分,在魚類生理和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,血清TP、ALB 主要參與維持機(jī)體內(nèi)血漿膠體滲透壓的穩(wěn)定性,其中TP 還可維持血管內(nèi)酸堿度的平衡[12]。本試驗(yàn)中,鹽堿脅迫組血清TP、ALB 水平均顯著高于對(duì)照組,表明水體鹽堿濃度的升高改變了機(jī)體滲透壓,刺激機(jī)體提高ALB 水平。血清UREA 含量的變化反應(yīng)了動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況。本試驗(yàn)中各處理組異育銀鯽血清UREA 含量均高于對(duì)照組,其中高濃度的鹽堿脅迫組與對(duì)照組差異顯著,說明高濃度的鹽堿脅迫對(duì)異育銀鯽機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝有顯著抑制作用。ALT 和AST 是魚類機(jī)體內(nèi)重要的氨基轉(zhuǎn)移酶[13],是氨基酸代謝中不可或缺的酶類,其活性的變化不僅反應(yīng)魚類氨基酸的代謝狀況,而且也從側(cè)面反應(yīng)出魚類肝功能的健康狀況[14]。本試驗(yàn)中,鹽堿脅迫組血清ALT 及AST活性均顯著低于對(duì)照組,表明異育銀鯽肝胰臟的代謝功能受到抑制。LDH 水平的改變直接對(duì)機(jī)體的能量代謝產(chǎn)生影響,組織病變或受損可引起細(xì)胞膜的通透性增加,導(dǎo)致大量LDH 釋放至血液中。本試驗(yàn)中,不同濃度鹽堿脅迫組異育銀鯽血清LDH 水平顯著高于對(duì)照組,表明其機(jī)體受到鹽堿脅迫所導(dǎo)致的損傷作用。AKP 參與動(dòng)物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運(yùn)輸,而且是動(dòng)物解毒體系中重要的一部分。本試驗(yàn)中,鹽堿脅迫組AKP 水平均顯著高于對(duì)照組,表明鹽堿脅迫對(duì)異育銀鯽產(chǎn)生的毒性作用刺激機(jī)體AKP 水平的提高,從而緩解機(jī)體損傷。

3.3 鹽堿脅迫對(duì)異育銀鯽肝胰臟抗氧化酶活力的影響 活性氧自由基(ROS)[15]為動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的一種中間產(chǎn)物,其對(duì)維持基因調(diào)控、細(xì)胞增殖分化及其他生理調(diào)節(jié)起著不可或缺的作用。鹽堿脅迫會(huì)導(dǎo)致ROS 的生成量超過機(jī)體的負(fù)荷量,并累積于肝臟中,造成核酸損傷、蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化[16]。SOD 及CAT 作為抗氧化防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶類,通過催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)或?qū)C(jī)體內(nèi)H2O2還原成水,來實(shí)現(xiàn)抗氧化防御減少機(jī)體損傷[17]。王卓等[18]將耐鹽堿能力較強(qiáng)的青海湖裸鯉暴露32 mmol/L 和64 mmol/L 的鹽堿水中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 d 內(nèi)裸鯉肝胰臟SOD 活力表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。楊等[19]測(cè)定了10 d 內(nèi)不同濃度鹽堿暴露下大鱗鲃肝組織SOD 及CAT 活性變化,結(jié)果顯示,其活性隨著鹽堿暴露濃度升高及時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。本試驗(yàn)也得到相似的結(jié)果,相比于對(duì)照組,鹽堿脅迫Ⅱ組SOD 及CAT 活性顯著升高,Ⅲ、Ⅳ組均顯著降低。表明低濃度的鹽堿脅迫可促使異育銀鯽機(jī)體產(chǎn)生反饋抵抗機(jī)制以應(yīng)對(duì)應(yīng)激反應(yīng),隨著鹽堿濃度升高,抗氧化酶活性受到抑制,因而對(duì)機(jī)體造成了氧化損傷。

4 結(jié)論

綜上試驗(yàn)結(jié)果表明,本試驗(yàn)條件下,高鹽堿濃度水體能降低異育銀鯽的存活、增重,引起魚體產(chǎn)生慢性損傷,對(duì)其健康產(chǎn)生負(fù)面影響。