兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定與調(diào)查

馬超鋒

(1.河南省信陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南 信陽(yáng) 464000)

支氣管敗血波氏桿菌(B6)是一種革蘭陰性小桿菌,可以引起多種哺乳動(dòng)物(包括豬、兔、綿羊、牛、馬、犬、鼠類等)呼吸道的急性或慢性炎癥[1-2],輕則影響動(dòng)物生長(zhǎng)、重則造成家畜死亡,給養(yǎng)殖場(chǎng)戶帶來(lái)一定經(jīng)濟(jì)損失。筆者在臨床工作中,時(shí)常接到發(fā)生呼吸道癥狀的病兔,為更好的防治該病,我們將收集到的病兔進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定與藥敏試驗(yàn),并對(duì)河南部分地區(qū)的兔支氣管敗血波氏桿菌發(fā)病情況進(jìn)行了初步調(diào)查,以期為該病的防控提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病料收集 2018 年11 月信陽(yáng)地區(qū)某兔場(chǎng)兔群發(fā)生打噴嚏、呼吸困難、不食、消瘦及鼻炎癥狀,無(wú)菌取病死兔的鼻拭子或鼻腔分泌物,保存?zhèn)錂z;于2016 年7 月-2018 年6 月,在河南部分地區(qū)(信陽(yáng)、焦作、濟(jì)源、三門(mén)峽、駐馬店和洛陽(yáng)等地)有呼吸道癥狀兔養(yǎng)殖場(chǎng)采集鼻拭子樣品684 份,冷凍保存?zhèn)錂z。

1.2 主要試劑 DNA 提取試劑盒,購(gòu)自TaKaRa 公司;普通TapDNA 聚合酶、10×緩沖液、dNTP、DNA Marker、瓊脂糖等,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;TSB 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血瓊脂平板、胎牛血清、細(xì)菌生化鑒定管、藥敏片(部分自制)等,購(gòu)自鄭州安圖綠科生物公司;革蘭染色試劑根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]自行配置。

1.3 主要儀器 生物顯微鏡(日本Nikon 公司);5424R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司);核酸提取儀(西安天隆科技有限公司);PCR 儀(德國(guó)Biometre 公司);電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(以色列DNA 公司);HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠);SPX-150B 智能型生化培養(yǎng)箱(上海瑯軒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.4 細(xì)菌分離鑒定及鏡檢 將新鮮無(wú)菌采集的兔鼻腔分泌物,劃線接種于血瓊脂平板、麥康凱平板上,37 ℃溫箱培養(yǎng)24～48 h 后,觀察菌落形態(tài),挑取優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)菌落繼續(xù)純培養(yǎng);取兔鼻腔分泌物、單個(gè)培養(yǎng)基菌落涂片,革蘭染色,顯微鏡下觀察。

1.5 生化鑒定 在含有5%胎牛血清的LB 液體培養(yǎng)基中接種純培養(yǎng)物,取少量培養(yǎng)液加入各個(gè)生化鑒定管中,在溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h 后,觀察并記錄結(jié)果。

1.6 細(xì)菌的PCR 鑒定及測(cè)序 采用DNA 提取試劑盒提取分離菌及采集的鼻拭子的DNA。

參考文獻(xiàn)[4],建立基于多殺性巴氏桿菌16S rDNA 基因的PCR 檢測(cè)方法;上游引物：5′-AGTGGGATTAGGTAGTTGGT-3′,下游引物：5′-CTGTAATTAACGTCAATG-3′,擴(kuò)增片段大小為258 bp;反應(yīng)條件：95 ℃5 min,94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃1 min,35 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。

參照筆者建立的兔敗血支氣管波氏桿菌PCR檢 測(cè)方法[5]操作;上游引物：5′-GGCACCATCAAAACGCAGAGGGG-3′,下游引物：5′-ATTACCGAGTTGGGCGGGGCTG-3′,擴(kuò)增片段大小870 bp;反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s,57 ℃退火30 s,72 ℃復(fù)性1 min,30 個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。對(duì)采集的樣品及培養(yǎng)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,電泳檢測(cè),提取陽(yáng)性質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較。

1.7 藥敏試驗(yàn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)[3,6-9],利用紙片法測(cè)定分離的支氣管敗血波氏桿菌對(duì)慶大霉素、克林霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、鹽酸多西環(huán)素、阿莫西林、氟苯尼考、鏈霉素、頭孢克肟、頭孢拉定等10 種藥物的敏感性,通過(guò)測(cè)定抑菌圈的直徑(Φ)判定藥物對(duì)病原菌的敏感性：Φ≥15 mm 為高度敏感;6 mm≤Φ＜15 mm 為中度敏感;Φ＜6 mm 為耐藥。

1.8 兔支氣管敗血波氏桿菌感染情況調(diào)查 將采自河南信陽(yáng)、焦作、濟(jì)源、三門(mén)峽和洛陽(yáng)等地的684份兔鼻拭子樣品進(jìn)行PCR 檢測(cè),調(diào)查兔群支氣管敗血波氏桿菌的陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及鏡檢結(jié)果 分離菌在血瓊脂平板培養(yǎng)48 h 后,形成隆起的中等大小的圓整、光滑、濕潤(rùn)、透明菌落,邊緣整齊,產(chǎn)生β 溶血環(huán);分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落呈藍(lán)灰色。革蘭染色后,顯微鏡下觀察,可見(jiàn)單個(gè)散在、兩極染色的球桿菌,革蘭陰性(見(jiàn)中插彩版圖1),結(jié)合生化鑒定結(jié)果初步判定為支氣管敗血波氏桿菌。

圖1 分離菌株的染色鏡檢圖片(10×100)

2.2 生化鑒定結(jié)果 該分離菌株生化鑒定結(jié)果,能利用檸檬酸鹽,還原硝酸鹽,分解尿素,觸酶、氧化酶、脲酶陽(yáng)性;不發(fā)酵糖類,不產(chǎn)生硫化氫,甲基紅、V-P 和吲哚試驗(yàn)陰性。

2.3 分離菌株P(guān)CR 鑒定結(jié)果 將分離細(xì)菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、1%瓊脂糖凝膠電泳后,巴氏桿菌擴(kuò)增結(jié)果為陰性;在870 bp 處出現(xiàn)明顯條帶,與預(yù)期目的片段一致,將測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表的兔波氏桿菌基因序列比對(duì),同源性達(dá)99.2%以上,確定本試驗(yàn)分離菌為支氣管敗血波氏桿菌(見(jiàn)圖2)。

圖2 被檢樣品兔支氣管敗血波氏桿菌PCR 擴(kuò)增圖

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,分離細(xì)菌對(duì)慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考高敏;對(duì)諾氟沙星、鹽酸多西環(huán)素中敏;對(duì)克林霉素、阿莫西林、鏈霉素、頭孢克肟、頭孢拉定不敏感。

2.5 兔波氏桿菌調(diào)查情況 利用PCR 方法,將采自河南信陽(yáng)、駐馬店、濟(jì)源等地區(qū)的684 份兔鼻拭子樣品進(jìn)行PCR 檢測(cè),81 份樣品陽(yáng)性,陽(yáng)性率為11.8%。從表2 可以看出,各地陽(yáng)性率有差異。

表1 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 河南不同地區(qū)兔群波氏桿菌感染情況

3 討論

波氏桿菌病是一種重要的人獸共患病,對(duì)人畜健康均能造成較大威脅,因此對(duì)波氏桿菌的研究具有重要的公共衛(wèi)生意義。對(duì)兔群來(lái)說(shuō),在秋冬季節(jié)及氣溫驟變時(shí),較易發(fā)生呼吸道疾病,而且以發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高為特征,多為混合感染,給診斷和治療帶來(lái)難度。兔傳染性鼻炎是由多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌混合或單一感染引起的疾病,不同品種、不同年齡均易感,影響兔群采食和生長(zhǎng),是造成家兔生長(zhǎng)遲緩的重要因素。本試驗(yàn)采用細(xì)菌分離培養(yǎng)、鏡檢、生化及PCR 鑒定等手段,在信陽(yáng)地區(qū)發(fā)生呼吸道疾病的兔群中分離到兔源支氣管敗血波氏桿菌;為防治該病,采用藥敏試驗(yàn)篩選出恩諾沙星、氟苯尼考、慶大霉素為高敏藥物。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,推薦養(yǎng)殖戶采用慶大霉素配合清瘟敗毒散拌料連用7 d 防治,后經(jīng)回訪得知,兔場(chǎng)病情已得到有效控制。

對(duì)河南信陽(yáng)、濟(jì)源、洛陽(yáng)、焦作、三門(mén)峽和駐馬店等部分地區(qū)兔群的波氏桿菌感染情況進(jìn)行了調(diào)查,總體陽(yáng)性率為11.8%,感染率較高的濟(jì)源為15.4%,最低的信陽(yáng)為8.9%,該菌在我省不同地區(qū)兔場(chǎng)不同程度存在,從業(yè)者要加強(qiáng)對(duì)兔支氣管敗血波氏桿菌病的診斷和防治,以減少該病帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。

兔支氣管敗血波氏桿菌是呼吸道傳染病病菌,可經(jīng)病兔噴嚏、咳嗽產(chǎn)生的飛沫等分泌物污染的飼料、飲水、物品和環(huán)境傳播,建議兔場(chǎng)采取綜合性防控措施來(lái)防治該?。阂皇菆?jiān)持自繁自養(yǎng),防止外來(lái)病菌進(jìn)入兔群,定期采用細(xì)菌學(xué)或者血清學(xué)方法對(duì)兔群進(jìn)行抽檢,發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性立即淘汰;二是引種時(shí),首先要隔離觀察1 個(gè)月,并進(jìn)行檢測(cè),及時(shí)淘汰陽(yáng)性兔,無(wú)可視癥狀后再轉(zhuǎn)群;三是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,改善飼養(yǎng)環(huán)境,給兔群營(yíng)養(yǎng)合理的飼料,定期在飼料中添加保健性藥物,在季節(jié)變換和氣溫驟變時(shí)要及時(shí)在飼料或飲水中添加抗應(yīng)激藥物,提高兔群抵抗力;四是兔舍的清潔衛(wèi)生要做好,定期驅(qū)蟲(chóng)、滅鼠,及時(shí)清糞,保持兔舍合適的溫濕度,減少各種應(yīng)激因素;五是發(fā)病兔群可以制備自家苗,有針對(duì)性的免疫兔群。