鷹嘴豆芽素A 免疫佐劑作用試驗

陳洪博,李培華,蔡 翔,邱龍新

(1.龍巖學院 生命科學學院,福建 龍巖364012;2.福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室,福建 龍巖 364012)

疫苗免疫是防控動物傳染病的重要手段之一,近年來疫苗已使用許多亞單位抗原和多肽抗原,此類抗原具有純度高、安全性好等特點,但免疫原性較差,不能有效的誘導免疫反應,因此使用佐劑來提高其免疫原性具有重要意義。目前應用于畜禽的疫苗佐劑有弗氏佐劑、氫氧化鋁等,此類佐劑雖然均可提高疫苗的免疫效果,但在使用的安全性上還存在不足。與合成藥物相比,中藥具有多效性、雙向免疫調(diào)節(jié)性、不良反應少等特點,因此將中藥開發(fā)研制成安全有效的疫苗佐劑具有廣闊的應用前景。鷹嘴豆芽素A(BiochaninA,BioA)屬于黃酮類化合物,是紅車軸草中的主要有效成分,紅車軸草中含有大量異黃酮和黃酮類物質,其異黃酮是免疫調(diào)節(jié)劑及免疫刺激劑,具有抗病毒、抗腫瘤及消炎的作用。研究發(fā)現(xiàn)紅車軸草總黃酮短期內(nèi)在一定濃度范圍內(nèi)可通過增強巨噬細胞的吞噬能力,增強小鼠特異性免疫功能[1]。BioA 作為紅車軸草異黃酮的主要有效成分,目前研究主要集中在其抗腫瘤和抗氧化等方面,研究發(fā)現(xiàn),BioA 可調(diào)節(jié)細胞因子分泌、減輕肝損傷、保護大腦神經(jīng)元等[2-4],而有關BioA 的免疫佐劑作用尚未見報道,本試驗擬利用不同濃度BioA 與雞卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)聯(lián)合免疫小鼠,通過檢測免疫小鼠IgG 及其亞型抗體水平、脾臟淋巴細胞增殖、細胞因子分泌和CD4+、CD8+T 細胞亞群變化,探討B(tài)ioA 作為疫苗免疫佐劑的應用前景,從而為開發(fā)新的中藥佐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鷹嘴豆芽素A、OVA、LPS 和ConA(Sigma 產(chǎn)品);HRP 標記山羊抗小鼠IgG 抗體、IgG1抗體、IgG2a 抗體(Abcam 產(chǎn)品);CCK-8 試劑盒(碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品);抗小鼠CD3e-PECy5、CD4-FITC、CD8a-PE 單克隆抗體(eBioscience產(chǎn)品);IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和TNF-α(上海西唐生物科技有限公司產(chǎn)品);氫氧化鋁膠佐劑(中國牧工商集團有限公司產(chǎn)品)。

1.2 實驗動物 清潔級雌性ICR 小鼠60 只,體重18～22 g,由上海實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(滬)2016-0003],飼養(yǎng)于IVC 獨立送風飼養(yǎng)籠具,飼喂高壓滅菌飼料和水,室內(nèi)溫度25±5 ℃,濕度50%±10%,適應性飼養(yǎng)1 周后開始試驗。

1.3 分組及免疫程序 將60 只ICR 小鼠隨機分為6 組,每組10 只小鼠,分別是空白對照組(生理鹽水)、OVA 抗原組、OVA 抗原加鋁膠佐劑組(200 μg/只)、OVA 抗原加BioA 低劑量組(50 μg/只)、OVA抗原加BioA 中劑量組(100 μg/只)和OVA 抗原加BioA 高劑量組(200 μg/只),OVA 注射量為10 μg/只,每只小鼠皮下注射0.1 mL OVA 抗原+0.1 mL不同濃度的樣品,小鼠首免后21 d 進行二次免疫,二免后2 周殺小鼠用于后續(xù)試驗。飼養(yǎng)過程中同時觀察2 次免疫后小鼠精神狀態(tài)和行為變化,記錄試驗結束前1 d 小鼠體重。

1.4 IgG 及其亞型檢測 間接ELISA 法檢測抗OVA 抗體IgG、IgG1 和IgG2a 水平,具體方法參考文獻[5]。

1.5 淋巴細胞增殖檢測 無菌操作取小鼠脾臟,制備淋巴細胞懸液,調(diào)整細胞濃度到2.5×106個/mL備用。培養(yǎng)液LPS 終濃度為7.5 μg/mL,ConA 和OVA 終濃度為10 μg/mL,設置陰性對照和空白對照。培養(yǎng)72 h,培養(yǎng)結束前4 h 加入10 μL CCK-8,酶標儀測定OD450nm值。淋巴細胞刺激指數(shù)(Stimulationindex,SI)=(OD刺激孔-OD空白孔)/(OD未刺激孔-OD空白孔)。

1.6 血清細胞因子濃度測定 按照ELISA 試劑盒操作步驟,檢測血清中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和TNF-α 濃度。

1.7 外周血淋巴細胞亞群測定 收集小鼠肝素鈉抗凝外周血,取100 μL 抗凝血裂解紅細胞,洗滌并重懸細胞,用BD FACS Calibur 流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群CD4+和CD8+比值變化,FlowJo 7.6軟件分析試驗結果。

1.8 數(shù)據(jù)分析 試驗結果表示為平均值±標準差,使用SPSS 20.0 軟件單因素方差分析和LSD 法進行組間比較,P＜0.05 代表差異顯著,P＜0.01 代表差異極顯著。

2 結果

2.1 臨床觀察 一免和二免后小鼠的精神狀態(tài)、活動能力及皮毛狀態(tài)等均無異常變化;試驗結束前1 d稱重,與對照組相比,各佐劑組小鼠的體質量均未見顯著變化,表明BioA 和鋁膠佐劑對小鼠的體重變化無明顯影響。

2.2 抗OVA 特異性抗體IgG、IgG1 和IgG2a 的檢測 OVA 抗原與BioA 共免疫小鼠抗體水平檢測顯示,二免后鋁膠組和BioA 組IgG 抗體水平極顯著高于OVA 組(P＜0.01),鋁膠組IgG 抗體水平高于BioA 組,但無顯著差異,BioA 中劑量組IgG抗體水平高于低劑量組高劑量組,但三組之間無顯著差異(圖1A)。IgG1 抗體濃度檢測結果表明,與OVA 組相比,鋁膠組和BioA 組極顯著升高(P＜0.01),鋁膠組IgG1 水平顯著高于BioA 組(P＜0.05),BioA 三組之間無顯著差異,但中劑量組IgG1 抗體水平最高(圖1B)。IgG2a 抗體濃度檢測結果表明,與OVA 組相比,BioA 中劑量組抗體水平顯著升高(P＜0.05),其他組與OVA 組相比有升高趨勢但差異不顯著(圖1C)。

2.3 淋巴細胞增殖試驗結果 小鼠免疫BioA 100 μg 后,脾臟淋巴細胞體外受ConA、LPS 和OVA 刺激產(chǎn)生的淋巴細胞增殖能力顯著或極顯著高于OVA 組(P＜0.05 或P＜0.01);與OVA 組相比,BioA 低劑量組和高劑量組脾臟淋巴細胞受ConA 刺激后增殖能力顯著升高(P＜0.05)。與OVA 組相比,鋁膠佐劑組和BioA 組脾臟淋巴細胞接受OVA 刺激后淋巴細胞增殖水平有升高,但差異不顯著(圖2)。

2.4 細胞因子濃度檢測結果 與OVA 組相比,BioA組和鋁膠組均能顯著提高IL-2、IL-4 的濃度(P＜0.05),鋁膠組的表達量要高于BioA 組,但二者之間無顯著差異;BioA 能顯著提高IFN-γ、TNF-α 的濃度(P＜0.05),而鋁膠組能提高IFN-γ、TNF-α 的表達,但與OVA 組相比無顯著差異;BioA 組和鋁膠組均能提高IL-5 的濃度,但與OVA 組相比無顯著差異(圖3)。

圖1 小鼠血清IgG 抗體及其亞型水平

圖2 小鼠脾臟淋巴細胞增殖結果

圖3 小鼠血清細胞因子檢測結果

2.5 T 淋巴細胞亞群的檢測 OVA 組、鋁膠組和BioA 組CD4+和CD8+T 淋巴細胞檢測結果分別如圖4C、4D 和4E 所示,結果顯示,與OVA 組比較,OVA聯(lián)合BioA 或鋁膠極顯著或顯著升高小鼠外周血中CD4+T 淋巴細胞比例(P＜0.05 或P＜0.01),BioA組較鋁膠組略有升高,但兩組之間差異不顯著;與OVA 組比較,OVA 聯(lián)合BioA 或鋁膠可降低CD8+T淋巴細胞的比例,但三組之間差異不顯著;同時,鋁膠組和BioA 組CD4+/CD8+T 淋巴細胞的比值也顯著或極顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01);與OVA 組和鋁膠組相比,BioA 組CD3+/CD4-/CD8-細胞數(shù)量顯著降低,表明BioA 可刺激機體淋巴細胞的分化。

3 討論

新一代的疫苗,特別是那些基于重組蛋白和DNA 疫苗,可能會比傳統(tǒng)疫苗的反應原性和免疫原性弱,因此,迫切需要開發(fā)和改進疫苗佐劑。佐劑對機體免疫反應有顯著影響,可使機體免疫系統(tǒng)趨向于Th1 或Th2 免疫類型[6-7]。雖然在臨床生產(chǎn)中疫苗已經(jīng)使用了多種佐劑,但這些佐劑大多只引起Th2 型抗體反應,或有不良副作用,限制了它們在疫苗中的潛在應用[8-10]。目前常用的佐劑主要刺激Th2 型免疫應答,不能刺激CTL 產(chǎn)生,此種免疫反應通常對細胞內(nèi)病原體無效,Th1/Th2 型免疫應答很大程度上依賴于佐劑類型[11-13]。

圖4 外周血中CD4+和CD8+T 淋巴細胞的表達

本試驗中BioA 和OVA 抗原聯(lián)合免疫小鼠后,可提高IgG 抗體水平,且具有劑量依賴性,100 μg 劑量組效果最佳,然而表達量低于鋁膠組,但兩者之間無顯著差異;鋁膠組和BioA 組均極顯著提高IgG1 的表達(P＜0.01),與BioA 組相比鋁膠組IgG1 的表達量顯著升高(P＜0.05);BioA 100 μg 劑量組可顯著提高IgG2a 表達量(P＜0.05),而鋁膠對IgG2a 的表達量無顯著影響。IgG 抗體及其亞型檢測結果表明鋁膠佐劑能顯著誘導Th2 型免疫反應,而對Th1 型免疫反應效果較差,BioA 佐劑在提高Th2 型免疫反應方面不如鋁膠佐劑,但對Th1 型免疫反應要優(yōu)于鋁膠。淋巴細胞增殖試驗結果表明,BioA 組受ConA、LPS 和OVA 刺激后淋巴細胞增殖能力均顯著高于OVA 組(P＜0.05),因此,BioA能同時刺激T、B 淋巴細胞的增殖。細胞因子檢測結果表明,BioA 可提高Th1 型細胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)和Th2 型細胞因子(IL-4)的表達量,而鋁膠佐劑對Th2 型細胞因子(IL-4)的表達量顯著升高,對Th1 型細胞因子(IFN-γ 和TNF-α)的表達無顯著作用,提示BioA 佐劑可誘導機體Th1 和Th2 型免疫應答反應,有助于細胞免疫體液免疫的產(chǎn)生。

CD4+T 細胞能調(diào)控和輔助其他淋巴細胞發(fā)揮功能,CD8+T 細胞具有免疫抑制和細胞毒性作用,CD4+/CD8+比值是判斷機體免疫功能狀態(tài)的重要指標,正常小鼠CD4+/CD8+比值為1～ 2[14-15]。本研究中BioA 佐劑能顯著增加CD4+T 細胞表達(P＜0.05),對CD8+T 細胞表達無顯著影響,但CD4+/CD8+值呈升高趨勢,機體內(nèi)CD3+/CD4-/CD8-細胞數(shù)量顯著降低,表明BioA 可刺激機體淋巴細胞的分化。

本試驗結果發(fā)現(xiàn),適當濃度的BioA 能促進機體Th1 和Th2 型細胞活化增殖,提高機體內(nèi)IgG1 和IgG2 抗體水平,能促進OVA 誘導的細胞免疫和體液免疫反應。綜上,本試驗表明,BioA 具有免疫佐劑效果。