蝦肝腸胞蟲LAMP 檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用

陳進(jìn)會,陳珍容,劉國慶,陳 洵,段麗萍,謝 會,石 磊

(1.黃埔海關(guān)技術(shù)中心,廣東 東莞 523072;2.四川省中江縣畜牧局,四川 德陽 618107;3.暨南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)研究院,廣東 廣州 510025)

隨著對蝦需求量的不斷增加,國內(nèi)對蝦養(yǎng)殖業(yè)大規(guī)模擴(kuò)建,存在的病害問題變得更加尖銳,直接或間接威脅到整個蝦類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)全球水產(chǎn)養(yǎng)殖聯(lián)盟調(diào)查,約40%對蝦養(yǎng)殖病害源于細(xì)菌性和寄生蟲疾病等[1]。其中,對對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害較嚴(yán)重的寄生蟲疾病就包括肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP),全名為“腸道上皮細(xì)胞微孢子蟲”,屬于微孢子蟲目(Microsporidia)、微孢子蟲科(Nosematidae)、腸胞蟲屬(Enterocytozoon),最初是在泰國養(yǎng)殖池塘生長遲緩的斑節(jié)對蝦中發(fā)現(xiàn)[2]。與急性肝胰腺壞死病(AHPND)的暴發(fā)一樣,EHP 在感染早期階段,不會引起對蝦死亡或產(chǎn)生其他明顯癥狀,但會導(dǎo)致對蝦生長緩慢。在這一背景下,對對蝦病害的有效防控關(guān)系到對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,將對蝦病害疫情的早期快速檢測作為病害防控的關(guān)鍵點,可提高檢測效率,并在病害發(fā)生的源頭加強(qiáng)監(jiān)控,降低病害發(fā)生率和蔓延程度。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定不適用于肝腸胞蟲這一類長度較小的寄生蟲,更多的是分子生物學(xué)檢測方法,如普通PCR、實時熒光定量PCR 和LAMP等[3-6]。但PCR 方法在一定程度上存在操作繁雜、費時等缺點,不適用于現(xiàn)場檢測,而環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增無需循環(huán)變溫,只需較短時間和簡易儀器就能完成高靈敏度、高特異性的擴(kuò)增。因此,在本研究中,根據(jù)EHP 的18S 保守區(qū)域設(shè)計LAMP 引物,從中篩選出一套擴(kuò)增效率較高的引物,并優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。該方法的特異性、靈敏度和精密度也得到了驗證。通過對不同地區(qū)實際對蝦樣品進(jìn)行檢測,驗證該方法用于現(xiàn)場檢測樣品的可行性,已建立的LAMP 方法可作為EHP 檢測和監(jiān)測的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 樣品來源：蝦肝腸胞蟲陽性樣品為本實驗室分離鑒定并保存。其他病原如傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)、對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、斑節(jié)對蝦桿狀病毒(MBV)、蝦細(xì)菌性肝胰腺壞死病毒(NHPB)、對蝦桿狀病毒(BP)、副溶血弧菌(VP)及南美白對蝦急性肝胰腺壞死病毒(AHPND)等均由本實驗室分離保存。試劑：MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、KCl、Tris-HCl、甜菜堿均為Sigma 公司;Tween 20、dNTPs、BstDNA 聚合酶均為天根生化科技(北京)有限公司;儀器：ABI Stepone plus 實時熒光定量PCR 儀、Nano drop 2 000超微量分光光度計均為北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司;Gel 2000 凝膠成像儀為美國伯樂公司;多功能臺式高速離心機(jī)為德國艾本德公司。

1.2 DNA 提取 副溶血弧菌核酸提取參照細(xì)菌DNA 抽提試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)說明書操作。其余病毒核酸參照水生動物病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒(廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司)說明書操作,并使用分光光度計Nano drop 2000 測定濃度,于-80 ℃儲存待用。

1.3 LAMP 引物設(shè)計與篩選 通過對蝦肝腸胞蟲的分子生物學(xué)信息分析,確定18S 基因作為其檢測基因,并對該基因組的同源序列進(jìn)行比對,結(jié)果表明,同源性高,特異性好。使用Primer Explorer V4 軟件(http：//primerexplorer.jp/e/;Eiken Chemical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)針對對蝦肝腸胞蟲18S 基因保守區(qū)域共設(shè)計4 套引物(生工生物工程(上海)服份有限公司合成,HPLC 純化)。

引物篩選實驗基于相關(guān)研究的反應(yīng)體系[7]。以EHP 陽性樣品核酸為陽性對照(Positive Control,PC),雙蒸餾水為陰性對照(Negative Control,NC)進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增。反應(yīng)程序為：63 ℃,30 s 預(yù)變性;63 ℃,15 s,63 ℃,45 s,60 個循環(huán),每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號;基于實時收集的熒光信號繪制熔解曲線(由65 ℃升溫至95 ℃,每0.5 s 增加0.5 ℃)。

1.4 LAMP 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化 為優(yōu)化反應(yīng)體系,對BstDNA 聚合酶濃度(U)(2.0,4.0,6.0,8.0,10.0),內(nèi)外引物濃度比(μmlo/L)(0.4：0.2,0.8：0.2,1.2∶0.2,1.6∶0.2,2.05∶0.2),dNTPs 濃 度(mmlo/L)(1.0,1.2,1.4,1.6,1.8)和Mg2+濃度(mmlo/L)(5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)進(jìn)行優(yōu)化。在確定LAMP 反應(yīng)體系后,對反應(yīng)溫度優(yōu)化,分別設(shè)置59 ℃、61 ℃、63 ℃、65 ℃和67 ℃。

1.5 LAMP 引物特異性檢測 為確認(rèn)LAMP 檢測的特異性,選用傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)、對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、斑節(jié)對蝦桿狀病毒(MBV)、蝦細(xì)菌性肝胰腺壞死病毒(NHPB)、對蝦桿狀病毒(BP)、副溶血弧菌(VP)及南美白對蝦急性肝胰腺壞死病毒(AHPND)基因組DNA 為模板進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增。并使用TE 緩沖液為陰性對照(NC),EHP 肝胰腺提取核酸為陽性樣品,質(zhì)粒DNA(10 fg/μL)為陽性對照(PC)。

1.6 LAMP 檢測質(zhì)粒DNA 靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 首先用外引物F3 和B3 擴(kuò)增含EHP 基因組的LAMP 靶區(qū)域片段。將獲得的PCR 產(chǎn)物純化并根據(jù)說明書克隆到pGEM-T Easy 載體(Promega,Fitchburg,W I,USA),得到重組質(zhì)粒pEasy-EHP,濃度為67 ng/μL,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA 使用TE 緩沖液10 倍梯度稀釋至1×100～1×10-7ng/μL,以此為為模板,雙蒸餾水作為陰性對照(NC),進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增。并根據(jù)其Ct值和初始模板質(zhì)粒DNA的對數(shù)量之間的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于定量分析。

1.7 檢出限及精密度試驗 根據(jù)靈敏度試驗結(jié)果,選用最低檢出濃度的質(zhì)粒溶液及其10 倍稀釋液為模板,各重復(fù)20 次,以確定該方法的檢出限。同時使用10 pg/μL 和1 pg/μL 為擴(kuò)增模板,各重復(fù)30次,根據(jù)擴(kuò)增曲線得出其Ct值,并計算變異系數(shù),以確定該方法的精密度。

1.8 人工侵染樣品檢測 取臨床檢測為陰性的健康對蝦的肝胰腺組織,分別加入終濃度分別為4.4 ng/μL、440 pg/μL、44 pg/μL、4.4 pg/μL、440 fg/μL 和44 fg/μL 的蝦肝腸胞蟲核酸。以此為模板,雙蒸餾水作為陰性對照(NC),進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增,每組進(jìn)行2 次重復(fù)。

1.9 實際樣品檢測 為進(jìn)一步評估LAMP 方法對現(xiàn)場采集樣品進(jìn)行診斷的可行性,用本研究建立的LAMP 方法對來自不同城市(海口,湛江,福建)的120 份對蝦樣品進(jìn)行檢測,同時使用qPCR 方法進(jìn)行確認(rèn),分析兩種檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 LAMP 引物篩選 根據(jù)圖1 的熔解曲線圖可知,EHP-2、EHP-3 和EHP-4 引物陰性對照均出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,故不可用于EHP 檢測。只有EHP-1 引物陽性對照在80.5 ℃有單一的熔解峰值,重復(fù)性好,不存在非特異性擴(kuò)增,故選用EHP-1 引 物(F3：5′-ACTATGCCGACAATGCTG-3′,B3：5′-TAGAAGATCTCACTGGTTCCA-3′,FIP：5′-TTAAGCAGCACAATCCACTCCTGATAGTACGCTCGCAAGG-3′,BIP：5′-GCGGGAAAACTTACCAGGGTCCATGCACCACTCTTGT-C-3′,LF：5′-GGTAGTGTCCTTCCGTCAATT-3′,LB：5′-ATCGTAGATTGGAGACATGAGG-3′)用于后續(xù)試驗。

圖1 4 組引物熔解曲線的比較

2.2 LAMP 反應(yīng)體系和條件優(yōu)化 對LAMP 反應(yīng)中的BstDNA 聚合酶濃度、內(nèi)外引物濃度比、dNTPs濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)溫度等因素進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,最佳反應(yīng)體系下BstDNA 聚合酶濃度為8 U,濃度過低會減慢鏈置換反應(yīng)速度;內(nèi)外引物濃度比為1.6∶0.2,內(nèi)引物濃度過高會增加了引物之間形成二聚體的機(jī)會,引起錯配和非特異性擴(kuò)增;dNTPs 濃度為1.6 mmol/L,Mg2+濃度為8 mmol/L,過低會降低BstDNA 聚合酶的活性,影響擴(kuò)增效率[8-10]。反應(yīng)溫度在63 ℃和65 ℃,擴(kuò)增效率幾乎一致,為節(jié)省能耗,選擇63 ℃為LAMP 反應(yīng)溫度。

2.3 LAMP 特異性檢測 LAMP 特異性試驗表明,除了EHP 質(zhì)粒DNA 外,只有EHP 陽性樣品能夠產(chǎn)生特異性擴(kuò)增(見封二彩版圖2)。而IHHNV、WSSV、MBV、NHPB、BP、VP 及AHPND 等不含靶區(qū)域的核酸在擴(kuò)增45 min 內(nèi)均沒有出峰。說明本文所建立的LAMP 方法對EHP 具有高度的特異性,可將EHP 與其他常見對蝦病害很好地進(jìn)行區(qū)分。

圖2 LAMP 特異性檢測

2.4 靈敏度驗證及標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 采用優(yōu)化好的LAMP 反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增,以1×100～1×10-7ng/μL 質(zhì)粒DNA 為模板,結(jié)果如封二彩版圖3所示,LAMP 在質(zhì)粒濃度為1×100ng/μL～1×10-5ng/μL 范圍內(nèi)均可對蝦肝腸胞蟲進(jìn)行檢測,且在45 min內(nèi)即可完成檢測,說明此方法檢測EHP 的靈敏度較高。檢出限的驗證試驗結(jié)果表明,20 組濃度為10 fg/μL的質(zhì)粒DNA 全部檢出,而1 fg/μL 質(zhì)粒DNA 均未檢出。因此,確定其檢出限濃度為10 fg/μL質(zhì)粒DNA。根據(jù)其Ct值和初始模板質(zhì)粒DNA 的對數(shù)量之間的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2＞0.98,P＜0.05),表明其滿足定量檢測的線性要求(圖4),并且根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,只需要得到目的基因的Ct值,就可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出EHP的含量,實現(xiàn)對EHP 的定量檢測。

圖3 LAMP 靈敏度檢測

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 LAMP 精密度驗證 由封二彩版圖5 可以看出,兩個濃度均可全部檢出。兩個濃度梯度下擴(kuò)增Ct值,變異系數(shù)分別為2.88%(10 pg/μL)和3.02%(1 pg/μL),滿足變異系數(shù)≦5%的要求,誤差在可接受范圍內(nèi)。表明建立的LAMP 檢測方法具有良好的重復(fù)性,擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖5 LAMP 精密度檢測

2.6 LAMP 檢測人工侵染樣品靈敏度 對于人工侵染的蝦肝腸胞蟲樣品檢測結(jié)果見表1,表明LAMP 在模板濃度為4.4 ng/μL～440 fg/μL 內(nèi)均可檢出,LAMP擴(kuò)增的最大Ct值為13.6。說明本文所建立的LAMP 檢測方法用于檢測EHP 具有較高靈敏度。

表1 LAMP 檢測EHP 靈敏性分析

2.7 實際樣品檢測 用建立的LAMP 方法與qPCR對120 份樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果見表2。LAMP 的陽性檢出率為36%,二者檢測結(jié)果符合率為97%,且LAMP 相對于qPCR 方法操作更加簡單,說明該方法可用于在養(yǎng)殖場對蝦肝腸胞蟲進(jìn)行監(jiān)測。

表2 LAMP 與qPCR 檢測臨床樣品的結(jié)果比較

3 討論

在全國對蝦產(chǎn)量不斷下降的趨勢下,中國對對蝦的需求量卻逐年增加[11],但對蝦病害發(fā)生的頻率和范圍也在不斷擴(kuò)大,檢出率也逐步上升。EHP 感染對蝦可導(dǎo)致對蝦生長緩慢,繁殖速度降低,給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。第九屆中國對蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展研討會指出：“肝腸包蟲在未來很可能成為危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的首要病害”,且對蝦受EHP 感染后,很難徹底消除[12],因此對對蝦病害的早期檢測及實時監(jiān)測顯得尤為重要,在染病早期發(fā)現(xiàn)并確定病原,就能有效采取防治措施,減少損失。

LAMP 檢測技術(shù)具有特異性好、靈敏度高、操作簡單、成本低等特點而被廣泛用于水產(chǎn)病害的檢測。本研究根據(jù)EHP 的18S 基因共設(shè)計4 套LAMP引物進(jìn)行篩選,得到最佳引物EHP-1,并對反應(yīng)體系中的BstDNA 聚合酶濃度、內(nèi)外引物濃度比,dNTP濃度,Mg2+濃度和反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗,最終確定了適用于檢測蝦肝腸胞蟲的LAMP 體系和條件。25 μL 反應(yīng)體系包括：12.5 μL LAMP 反應(yīng)緩沖液[緩沖液中各組分最終濃度為1.6 mmol/L dNTPs,1 mol/L 甜菜堿,6 mmol/L MgSO4,20 mmol/L Tris-HCl(pH 值8.8),10 mmol/L KCl,10 mmol/L(NH4)2SO4,and 0.1% Triton X-20,0.1% Triton X-20(Sigma-Aldrich Inc.,Saint Louis,M O,USA),廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司],0.2 μmol/L SYTO-9 fluorescent dye(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),1.2 μmol/L FIP/BIP,0.2 μmol/L F3/B3,1 對環(huán)引物L(fēng)oopF 和LoopB 的濃度均為0.8 μmol/L,6 UBstDNA 聚合酶,2 μL 模板DNA。反應(yīng)溫度為63 ℃,最短反應(yīng)時間為30 min。此外,本試驗所提出的LAMP 方法對傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)、對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、斑節(jié)對蝦桿狀病毒(MBV)、蝦細(xì)菌性肝胰腺壞死病毒(NHPBV)、對蝦桿狀病毒(BPV)、副溶血弧菌(VP)及南美白對蝦急性肝胰腺壞死病毒(AHPNDV)組織樣品等沒有交叉反應(yīng),說明具有良好的特異性。該方法可檢測濃度為1×100ng/μL～1×10-5ng/μL 的質(zhì)粒DNA,最低檢出限為10 fg/μL 的質(zhì)粒DNA,靈敏度較高,制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于對蝦肝腸胞蟲定量分析。而對于人工侵染的蝦肝腸胞蟲樣品,LAMP 方法可檢測低至440 fg/μL,敏感性較高。重復(fù)性試驗結(jié)果中變異系數(shù)為2.88%～3.02%,說明該方法具有良好的重復(fù)性。應(yīng)用建立的LAMP 方法對3 個不同地區(qū)的凡納濱對蝦樣品進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果顯示,EHP 陽性檢出率達(dá)36%,說明該地區(qū)對蝦已受蝦肝腸胞蟲污染,檢測結(jié)果與qPCR 符合率為97%,說明該方法可用于在養(yǎng)殖場對蝦肝腸胞蟲進(jìn)行監(jiān)測,具有良好的應(yīng)用前景。綜上所述,本試驗開發(fā)的LAMP 檢測方法可對EHP 的早期診斷提供有效指導(dǎo),避免病害進(jìn)一步發(fā)生,同時也是致病機(jī)理研究等相關(guān)研究工作的重要輔助手段。