高效液相色譜法測(cè)定恩拉霉素的含量

郭曉梅 郭雷

山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司 山東濟(jì)寧 272100

恩拉霉素（Enramycin）是由包括13個(gè)不同種類的17個(gè)氨基酸分子和脂肪酸分子組成的多肽類抗生素，包含恩拉霉素A和恩拉霉素B兩種成分，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有很強(qiáng)的抑制作用，它有利于飼料營(yíng)養(yǎng)成份的消化吸收，提高飼料利用率，是一種全新的動(dòng)物專用抗生素促生長(zhǎng)劑[1]。

目前，微生物學(xué)效價(jià)方法測(cè)定恩拉霉素含量較為普遍，在《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中，也是采用的微生物學(xué)方法，該方法操作復(fù)雜且有一定缺點(diǎn)，而高效液相色譜法由于其快速、準(zhǔn)確、操作方便的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較為廣泛。將HPLC法應(yīng)用到對(duì)恩拉霉素的檢測(cè)中，必然會(huì)給生產(chǎn)與研發(fā)帶來便捷。而HPLC法測(cè)定恩拉霉素含量的文獻(xiàn)鮮見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

戴安U-3000高效液相色譜儀和UV檢測(cè)器；梅特勒AB104-N型電子天平；FE20型酸度計(jì)。

恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品（含量為968u/mg）、恩拉霉素發(fā)酵液、恩拉霉素預(yù)混劑均有魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司提供；

甲醇浸提液：甲醇：2M鹽酸：水=20：1：21（V/V/V）

1.2 色譜條件

島津WondaSil C18（200×4.6mm，5μm，）為測(cè)定色譜柱，乙腈：50mM磷酸二氫鈉 3：7（V/V，pH 4.5±0.1）為流動(dòng)相，267nm的波長(zhǎng)，1.0ml/min的流速，柱溫選擇室溫，進(jìn)樣20μL，運(yùn)行20min。

1.3 工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品50mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，用甲醇浸提液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密量取該液2、4、6、8、10ml置于10ml量瓶中，用甲醇浸提液定容至刻度，搖勻，作為工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液，恩拉霉素含量分別為200、400、600、800、1000（ mg/ml）。

1.4 樣品溶液的制備

發(fā)酵液樣品處理：取發(fā)酵液2ml于一試管中，加18ml甲醇浸提液，搖勻后超聲30分鐘，離心后取上清液過0.45um濾膜（尼龍66）過濾，即得。

4%預(yù)混劑樣品處理：精密稱取1.00g 4%預(yù)混劑（或閃蒸粉）于 250ml三角瓶中，加入100ml甲醇浸提液，搖勻后超聲半小時(shí)，離心10分鐘，上清液用0.45μm濾膜過濾，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

分別將制備好的工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液用HPLC測(cè)定，以恩拉霉素濃度x（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=1695.4x+18095，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。結(jié)果表明恩拉霉素在濃度200-1000mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[2]。

2.2 精密度試驗(yàn)

在選定的色譜條件下，用恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，峰面積分別為 1702661、1704500、1704890、1704279、1707223，RSD為0.10%，由數(shù)據(jù)可知其精密度較好。

2.3 穩(wěn)定性考察

將供試品溶液放置12小時(shí)，測(cè)定初始值后，每隔兩個(gè)小時(shí)測(cè)定一次，對(duì)應(yīng)峰面積分別為1679528、1679282、1677904、1675449、1677717、1676122、1681359，

RSD為0.10%，說明在12小時(shí)內(nèi)溶液比較穩(wěn)定。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的供試品溶液，分別加入一定量的恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用HPLC測(cè)定，回收率為99.42%，RSD為2.08%，回收率良好。

2.5 耐用性試驗(yàn)

（1）改變柱溫：分別改變柱溫為 24.5℃、25.0℃、25.5℃，進(jìn)樣后記錄主峰峰面積和保留時(shí)間，并計(jì)算3針峰面積，分別為1755334、1725755、1725514，RSD 為 0.99%， 表 明 在 24.5-25.5℃適用該操作。

（2）改變色譜柱批號(hào)：選擇相同品牌，不同序列號(hào)（9E9601-03、2A9601-06、2A9601-09）的色譜柱進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明峰面積RSD為0.41%。

（3）改變流速：按照±10%的變量選擇0.9和1.1mL/min，進(jìn)樣后記錄主峰峰面積和保留時(shí)間，峰面積RSD為0.02%，表明流速在0.9-1.1ml/min范圍適用該操作。

2.6 樣品的含量測(cè)定

取恩拉霉素發(fā)酵液、恩拉霉素預(yù)混劑各3批樣品，按上述方法制備供試品溶液，用高效液相色譜儀檢測(cè)，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算預(yù)混劑含量，1602003批次為4.02%，1603001批次為3.98%，1603002為4.05%，說明批預(yù)混劑含量差異較小，樣品含量測(cè)定方法比較穩(wěn)定[3]。

3 結(jié)語

采用高效液相色譜法檢測(cè)恩拉霉素發(fā)酵液及預(yù)混劑中恩拉霉素的含量，實(shí)驗(yàn)所得線性方程為：y=1695.4x+18095，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，線性關(guān)系較好，該方法的回收率都95%-105%之間，符合分析要求。通過實(shí)驗(yàn)可知，我們選定的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、耐用性好等優(yōu)點(diǎn)，能有效的檢測(cè)發(fā)酵液、預(yù)混劑中恩拉霉素的含量。