PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

曹歡歡

朝陽市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心 遼寧朝陽 122000

PCR技術(shù)主要是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來對(duì)食品微生物進(jìn)行檢測，當(dāng)前有了較為廣泛的應(yīng)用，己經(jīng)成為食品微生物檢測的主要手段之一。通過PCR技術(shù)，能夠讓食品微生物檢測的精準(zhǔn)程度及效率得到提升，最大化地保障了人民群眾的飲食安全。

1 PCR技術(shù)概述

1.1 常規(guī)PCR檢測原理

在常規(guī)PCR檢測的過程中，必須按照DNA模板作為緩沖液，利用DNA的聚化酶催化增加寡核苷酸的片段，形成完整的生物周期循環(huán)模型樣片，保證檢測的效果更加精確。常規(guī)PCR沙門氏菌檢測總檢出率大約為99．8%，能夠?qū)?30株沙門氏菌以及100多種血清進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。

1.2 多重PCR檢測技術(shù)的概述

PCR中文名稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其主要是指在體外條件下，模板DNA在聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制的技術(shù)，其過程主要為變性、退火與延伸。雙鏈DNA通過熱變性會(huì)形成單鏈DNA，然后其和引物進(jìn)行結(jié)合，受到聚合酶的作用，核苷酸順著DNA單鏈逐漸延伸最終形成雙鏈，再將其當(dāng)作模板產(chǎn)生新的DNA雙鏈，如此不斷循環(huán)?？傮w來說，多重PCR在某一反應(yīng)體系之中加入超過兩對(duì)引物（包括兩對(duì)），從而產(chǎn)生更多的DNA序列[1]。

1.3 巢式PCR

巢式PCR能夠利用兩種不同的引物最DNA檢測片段進(jìn)行擴(kuò)充，利用第1套引物擴(kuò)張15-30個(gè)基因循環(huán)，然后根據(jù)DNA片段設(shè)定第2套引物，同樣擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán)，第2套引物即為內(nèi)引物。通過超巢式PCR能夠全面增強(qiáng)反應(yīng)的特異性，也能夠增強(qiáng)物異性和敏感性，對(duì)微生物的檢測和DNA的擴(kuò)增具有非常明顯的效果。

通常情況下，巢式PCR技術(shù)在第1次擴(kuò)張中必須打開反應(yīng)管，然后除去第2套引物才能夠增加第2套引物，所以巢式PCR自身的操作非常復(fù)雜。利用巢式PCR技術(shù)可以確保外引物的溫度明顯上升，并且直接將兩套引物同時(shí)增加到PCR反應(yīng)之中，如果內(nèi)引物不能夠繼續(xù)結(jié)合，則形成雙霉鏈，確保整個(gè)引物反應(yīng)系統(tǒng)穩(wěn)定性增強(qiáng)。在引物擴(kuò)增完畢后才能夠進(jìn)入低火溫皮下循環(huán)，在低溫作用下內(nèi)隱物會(huì)開始工作，如此的反復(fù)循環(huán)能夠快速的降低變性溫度，避免巢式PCR在循環(huán)的過程中產(chǎn)生產(chǎn)物檢驗(yàn)。

2 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用檢測

2.1 檢測大腸桿菌檢

大腸桿菌具備一定的毒素，并且這類毒素還有著一致性，采取傳統(tǒng)的血清法微生物檢測方式不能夠?qū)ζ溥M(jìn)行準(zhǔn)確的檢測。通過PCR技術(shù)，能夠有效檢測出大腸桿菌。與傳統(tǒng)檢測技術(shù)不同，PCR技術(shù)主要是對(duì)大腸桿菌的DNA雙鏈進(jìn)行檢測，很大程度上保證了檢測的準(zhǔn)確性。同時(shí)，部分技術(shù)人員將免疫磁分離技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，在牛肉之中成功檢測到了大腸桿菌，并通過stx，、stx2、hly等基因來對(duì)大腸桿菌的類型進(jìn)行了分析。

2.2 檢測沙門氏菌

在對(duì)食品進(jìn)行制作與加工時(shí)，會(huì)讓其中所含有的沙門氏菌含量減少，故而沙門氏菌在食品中的含量相對(duì)較少，在這樣的背景之下，檢測食品中的沙門氏菌就具備較高的難度。通過PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，一般選擇iNVA、B、C、E等特異性引物，來建立多重的PCR。從檢測結(jié)果能夠看出，一重、二重PCR之間并未存在著較大的差異，但采用三重PCR則相對(duì)來說更為準(zhǔn)確[2]。

2.3 檢測金黃色葡萄球菌

一般檢測法是檢測食品中金黃色葡萄球菌最常用的一種方法，首先，在無菌的環(huán)境下采取二十五克樣品食物，然后加入適當(dāng)含量的氯化鈉肉湯，攪拌稀釋后形成1/10稀釋液，其次，將制作好的稀釋液放置于36攝氏度左右的環(huán)境中，培養(yǎng)18至24小時(shí)，培養(yǎng)完成后將稀釋液用平板畫線法在血平板上畫線處理，再次在36攝氏度的環(huán)境中培養(yǎng)18至24小時(shí)。最后，經(jīng)過培養(yǎng)的平板上會(huì)出現(xiàn)一些顏色為灰黑色，呈圓形，并且周圍有些許雜質(zhì)和一層透明帶的物質(zhì)，將這些物質(zhì)采集下來經(jīng)過顯微鏡檢查和凝固酶實(shí)驗(yàn)就可以得到食品的金黃色葡萄球菌檢測。在金黃色葡萄球菌的生物分子檢測方法中，PCR檢測法是最主要的一種方法，PCR檢測法則既能檢測到活的金黃色葡萄球菌，又能檢測到死的金黃色葡萄球菌。因此，PCR檢測法與其他檢測方法相比較而言所得到的結(jié)果更加精準(zhǔn)，并且能在短時(shí)間內(nèi)得到檢測結(jié)果[3]。

2.4 檢測乳酸菌

與常規(guī)qPCR技術(shù)相類似，目前PMA-qPCR技術(shù)檢測單一乳酸菌的活菌數(shù)量已經(jīng)在很多乳酸菌菌株中研究成功，如副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌BB12等。我國張和平團(tuán)隊(duì)也報(bào)道了PMA-qPCR技術(shù)檢測植物乳桿菌P-8的研究。Desfossés-Foucault等在定量檢測鼠李糖乳桿菌時(shí)，還設(shè)計(jì)了一條探針引物以進(jìn)一步確保對(duì)目標(biāo)菌株計(jì)數(shù)的靈敏性和準(zhǔn)確性。但是，由于在乳酸菌食品中，一般是多種乳酸菌混合添加的，因此，同時(shí)檢測不同種乳酸菌的活菌數(shù)將更符合乳酸菌檢驗(yàn)的實(shí)際需要。Zorica等報(bào)道了利用設(shè)計(jì)的兼并引物，同時(shí)對(duì)Lb．plaNtarum 564和 Lb．paracasei Z-8 進(jìn)行檢測。

3 結(jié)語

隨著食品微生物檢測技術(shù)的快速發(fā)展，如何提高檢測的效率和精確度已經(jīng)成為食品微生物檢測發(fā)展的重要因素，目前PCR技術(shù)在實(shí)踐和應(yīng)用的過程中還存在某些缺陷，但是隨著PCR技術(shù)的快速發(fā)展與完善，食品微生物檢測的整體水平也會(huì)不斷提升?？偠灾⑸锏目焖贆z測在食品衛(wèi)生微生物檢測方面的作用越來越重要，PCR技術(shù)能夠融合免疫學(xué)分子生物學(xué)計(jì)算機(jī)技術(shù)，快速建立食品微生物檢測模型，確保食品微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)更高、效率更高、敏靈敏度更高，為我國的食品安全做出重要的貢獻(xiàn)。