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    AMG 510只是攻克RAS的一小步(二)

    2019-11-28 02:52:56謝雨禮
    國際人才交流 2019年11期

    文/謝雨禮

    (謝雨禮,畢業(yè)于南開大學(xué)化學(xué)系,取得中國科學(xué)院上海藥物研究所博士學(xué)位,在哥倫比亞大學(xué)從事博士后研究工作。2017年4月,創(chuàng)辦蘇州偶領(lǐng)生物醫(yī)藥有限公司,致力于創(chuàng)新化藥的研究和開發(fā))

    RAS的不可成藥性和藥物開發(fā)的探索

    為什么RAS難以成藥呢?首先,RAS各個(gè)亞型的D-domain高度類似,直接靶向RAS很難達(dá)到高度選擇性。第二,小分子藥物最常見的是抑制酶的活性,但RAS比較特殊,GTP水解酶與其功能反相關(guān),需要開發(fā)酶的激活劑。第三,藥物分子無法與底物競(jìng)爭(zhēng),因?yàn)镽AS與GTP的親和力常數(shù)達(dá)到皮摩爾級(jí)別,而細(xì)胞中GTP的濃度高達(dá)0.5mM。第四,除了不可逾越的核苷酸口袋,RAS蛋白其他地方缺乏有利于小分子結(jié)合的口袋。第五,RAS的調(diào)控和功能執(zhí)行都是通過蛋白—蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)的,很難通過小分子干預(yù)。這些蛋白相互作用發(fā)生在細(xì)胞膜內(nèi),單抗等大分子難以觸及。

    由于這些原因,制藥界早期將注意力轉(zhuǎn)移到RAS的高度可變區(qū)(HVR)。HVR是RAS用來定位細(xì)胞膜的區(qū)域,末端包含CAAX系列。RAS蛋白合成后,要進(jìn)行一系列修飾才能進(jìn)入細(xì)胞膜。CAAX系列的Cys被異戊烯化后,AAX被轉(zhuǎn)化酶RCE1切除,最后Cys的羧基被甲基轉(zhuǎn)移酶ICMT所甲基化。細(xì)胞膜定位對(duì)于RAS的功能至關(guān)重要,其調(diào)節(jié)蛋白如GEFs,GAPs以及各種效應(yīng)蛋白都依賴細(xì)胞膜移位進(jìn)行調(diào)控。讓人沒想到的是,抑制RCE1和ICMT有時(shí)反而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生,原因還不太清楚。其實(shí),抑制RAS通路的某個(gè)環(huán)節(jié)造成反向激活還比較常見,比如Raf和MEK抑制劑中都發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,這也是RAS藥物開發(fā)的一個(gè)難點(diǎn)。

    開發(fā)RAS異戊烯化抑制劑的探索就要曲折得多。早在1989年,美國西南醫(yī)學(xué)中心的科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)法尼基轉(zhuǎn)移酶(FT)介導(dǎo)的異戊烯化是RAS活性所必需的。FT抑制劑對(duì)RAS變異腫瘤有效且安全性可接受?;谶@些研究,F(xiàn)T抑制劑被推上了臨床,但臨床結(jié)果不理想,對(duì)于占大多數(shù)的KRAS和NRAS病人無效?;仡^分析,這里有一個(gè)“坑”當(dāng)時(shí)被忽視了。前面提到,HRAS是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RAS腫瘤基因,F(xiàn)T抑制劑早期工作都是基于HRAS突變展開的。不幸的是,RAS亞型的異戊烯化有所差異。FT被抑制后,KRAS和NRAS能夠通過GGTase1異戊烯化所彌補(bǔ),而HRAS卻不能。這樣,F(xiàn)T和GGTase1抑制劑聯(lián)用才能有效抑制KRAS和NRAS突變的腫瘤,但也容易產(chǎn)生不可耐受的毒副反應(yīng)。目前,F(xiàn)T抑制劑用于HRAS突變的病人仍在進(jìn)行臨床研究。今年9月,Kura公布了FT抑制劑tipifarnib的一個(gè)臨床結(jié)果:在13名攜帶HRAS突變的難治或是復(fù)發(fā)的膀胱癌病人中,ORR達(dá)到38%。異戊烯結(jié)合蛋白PDEδ是RAS細(xì)胞內(nèi)外膜之間穿梭運(yùn)輸?shù)闹匾閭H蛋白。2013年,德國馬克斯—普朗克研究所的科學(xué)家報(bào)道了第一個(gè)KRASPDEδ蛋白相互作用的小分子抑制劑Deltrasin,隨后又報(bào)道了毒性更小的Deltazinone,這些化合物可以有效抑制KRAS驅(qū)動(dòng)的胰腺癌。這一靶點(diǎn)迅速成為RAS藥物研究的熱點(diǎn),但還未有臨床研究數(shù)據(jù)報(bào)道。

    干預(yù)RAS細(xì)胞膜定位的藥物開發(fā)至少目前來看還不算成功。近年來,隨著共價(jià)、變構(gòu)、蛋白蛋白相互作用、PROTAC等小分子新技術(shù)的發(fā)展,RAS直接抑制劑又回到了人們的視野。1997年,Schering-Plough報(bào)道了第一個(gè)直接抑制RAS的小分子化合物。此后,大量RAS抑制劑被相繼報(bào)道,包括合成小分子、天然產(chǎn)物和多肽模擬分子,這些分子主要靶向RAS核苷酸交換,RAS-SOS和RAS-Raf相互作用等。還有Sulindac和Rigosertib等老藥或臨床化合物也發(fā)現(xiàn)直接作用于RAS。這些早期工作中,最受關(guān)注的是RAS-SOS抑制劑。SOS是最常見的GEF,如前所述,抑制GEF干擾GTP的結(jié)合。基因泰克2012年報(bào)道了通過NMR技術(shù)和Fragment-based技術(shù)發(fā)現(xiàn)的RAS-SOS小分子抑制劑DCAI,但這些化合物活性不高,而且隨后的研究發(fā)現(xiàn)RAS-SOS抑制劑也存在負(fù)反饋激活的問題。2019年,Bayer報(bào)道了一類通過雙向篩選獲得的KRAS G12C-SOS1抑制劑,穩(wěn)定KRAS-SOS1復(fù)合物同時(shí)抑制SOS1活性,活性達(dá)到納摩爾級(jí)別,且可以與G12C抑制劑聯(lián)用。

    KRAS G12C抑制劑的開發(fā)

    早期報(bào)道的RAS抑制劑由于各種原因,都沒有繼續(xù)開發(fā),這也是RAS得到“不可成藥”這個(gè)名聲的主要原因。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)興起后,藥物開發(fā)更加強(qiáng)調(diào)靶向腫瘤細(xì)胞特有的變異。RAS具有重要的生理功能,KRAS生殖突變的老鼠不能成活。RAS調(diào)節(jié)因子變異造成一組統(tǒng)稱為RASopathy的罕見病,僅NF1(GAP蛋白)變異,全球就超過10萬名病人。因此,避開正常細(xì)胞,特異性靶向腫瘤細(xì)胞RAS變異可能帶來較少的副作用。然而,前面提到RAS變異主要是G12、G13和Q61三個(gè)位點(diǎn),可逆競(jìng)爭(zhēng)性的小分子藥物要區(qū)分野生型和變異蛋白的結(jié)合口袋非常困難,更別提RAS蛋白上就沒有什么適合小分子結(jié)合的口袋。EGFR和BTK等基于半胱氨酸(Cys)共價(jià)結(jié)合的不可逆抑制劑的成功,讓KRAS G12C脫穎而出成為RAS變異的理想靶點(diǎn)。首先,G12C是第三大常見的RAS變異,特別是在非小細(xì)胞肺癌和腸癌中排在第一位,每年新發(fā)G12C腫瘤病人接近3萬人;其次,變異產(chǎn)生的Cys可以成為不可逆抑制劑進(jìn)攻的目標(biāo),減少對(duì)結(jié)合口袋的依賴;再次,Cys不可逆抑制劑已經(jīng)證明可以獲得相對(duì)較高的特異性;最后,G12C位于SWI、SWII以及P-loop三方交界的區(qū)域,抑制G12C可能對(duì)RAS構(gòu)象和活性產(chǎn)生重要影響。2013年UCSF的Shokat實(shí)驗(yàn)室在Nature上報(bào)道了通過“Tethering”技術(shù)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)G12C抑制劑。“Tethering”技術(shù)由同在UCSF的Wells James教授開發(fā),基本原理就是針對(duì)含有Cys的靶點(diǎn),利用雙硫鍵的小分子碎片庫進(jìn)行篩選。雙硫鍵與Cys的巰基發(fā)生交換后,小分子碎片就會(huì)通過Cys連接在蛋白上。這些懸掛在蛋白上的碎片很容易被隨后的還原處理所清除,而那些在Cys附近找到結(jié)合口袋躲避的碎片就會(huì)生存下來。篩選了480個(gè)雙硫化合物后,Shokat等人找到了兩個(gè)Hits,其中一個(gè)就是6H05。隨后開發(fā)這個(gè)項(xiàng)目的Wellspring公司進(jìn)行了一系列優(yōu)化,得到更為有效的先導(dǎo)化合物ARS-853。詳細(xì)研究發(fā)現(xiàn),這類化合物只能作用于GDP結(jié)合的RAS,化合物與G12C共價(jià)連接在Switch II下面誘導(dǎo)了一個(gè)此前不存在的變構(gòu)口袋S-IIP。這造成了兩個(gè)后果:RAS與GDP的親和力增加,不易轉(zhuǎn)向GTP構(gòu)象;抑制了GEF催化的核苷酸交換。簡(jiǎn)單地說,就是將RAS鎖在了非活性狀態(tài)。新的G12C抑制劑在體內(nèi)外腫瘤模型上都展現(xiàn)了很好的劑量關(guān)系和可預(yù)測(cè)的在靶活性。

    第一個(gè)KRAS G12C抑制劑的發(fā)現(xiàn)

    對(duì)于制藥公司來說,原創(chuàng)研究到此就基本夠了。但細(xì)細(xì)思考,還是有些讓人不解的地方。第一個(gè)就是,腫瘤細(xì)胞中變異的RAS主要以GTP結(jié)合的激活狀態(tài)存在,而這些G12C抑制劑只能靶向GDP結(jié)合的KRAS。第二個(gè)疑問是,共價(jià)抑制劑首先要與靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合,才能特異地與目標(biāo)位置的Cys快速反應(yīng);而G12C抑制劑與S-IIP口袋結(jié)合比較弱而且是事后誘導(dǎo)的。對(duì)于第一個(gè)問題,紐約MSKCC的Neal Rosen教授2016年在Science發(fā)表文章,提出了一個(gè)“Trapping”的作用機(jī)制。他們認(rèn)為KRAS G12C類似于野生型,也存在GTP/GDP循環(huán),因?yàn)镚12C內(nèi)在的GTPase活性并沒有下降。因此,RAS突變不是原來認(rèn)為的一直處于完全鎖死的激活狀態(tài),而是一種在接收刺激信號(hào)后“hyperactive”的狀態(tài)。這樣,G12C抑制劑不斷將RAS蛋白trap在GDP狀態(tài)而消耗GTP結(jié)合的RAS。這實(shí)際上是一個(gè)平衡反應(yīng),因此這類抑制劑需要較長(zhǎng)的作用時(shí)間。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)G12C抑制劑的臨床應(yīng)用是有重要指導(dǎo)意義的。因?yàn)樗幬锏淖饔檬抢瓌?dòng)一個(gè)平衡反應(yīng),也許需要較大的劑量,對(duì)于藥物的安全性要求比較高。另外,RAS突變?nèi)杂蠫TP/GDP循環(huán),也就是仍然受到各種信號(hào)的調(diào)控,這樣為G12C抑制劑與其他藥物,如EGFR抑制劑的聯(lián)用提供了可能。

    對(duì)于第二個(gè)問題,2018年Wellspring Biosciences的科學(xué)家發(fā)表了一項(xiàng)詳細(xì)研究。文章認(rèn)為G12C抑制劑與傳統(tǒng)的共價(jià)抑制劑不同,它們與Cys的結(jié)合不是親和力驅(qū)動(dòng)的,而是由化合物與Cys的高反應(yīng)性驅(qū)動(dòng)的。令人費(fèi)解的是,這些化合物以及G12C中的Cys,內(nèi)在的反應(yīng)性都很低,這也是為什么這類化合物的特異性非常好的原因。那問題是,這個(gè)特異的高反應(yīng)性從哪里來的?晶體結(jié)構(gòu)顯示,是因?yàn)镚12C附近的賴氨酸Lys16質(zhì)子化后,可以穩(wěn)定Cys共價(jià)反應(yīng)的過渡態(tài),起到自催化的作用。另外,由于GTP的gamma位磷酸可以干預(yù)Lys16的作用,可能是G12C抑制劑只能作用于GDP結(jié)合的RAS的原因之一。比較有意思的是,基于GDP結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的,以結(jié)合力驅(qū)動(dòng)的G12C共價(jià)抑制劑比如SML-8-73-1系列反而沒有取得理想的效果。這個(gè)案例顯示,一個(gè)非常淺、動(dòng)態(tài)的臨時(shí)誘導(dǎo)的結(jié)合口袋,雖然無法為小分子提供足夠的親和力,也能通過“高反應(yīng)性”驅(qū)動(dòng)的共價(jià)抑制劑有效抑制,這為小分子共價(jià)抑制劑在其他所謂“不可成藥”靶點(diǎn)的應(yīng)用提供了無限的遐想。

    RAS抑制劑巨大的商業(yè)前景,G12C扎實(shí)的基礎(chǔ)研究和有說服力的前期數(shù)據(jù),在制藥界激發(fā)了一股開發(fā)G12C抑制劑的熱潮,幾乎每個(gè)月都有新的專利公開。進(jìn)展最快的就是已經(jīng)公開一期臨床數(shù)據(jù)的安進(jìn),Wellspring和Mirati等公司的產(chǎn)品也已進(jìn)入臨床。其他大公司比如Pfizer、AZ都在跟進(jìn),國內(nèi)的fast-follow也是爭(zhēng)先恐后。

    G12C抑制劑開發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)

    KRAS G12C抑制劑的初步成功,無疑是令人興奮的。讓人們重新認(rèn)識(shí)了RAS生物學(xué),發(fā)現(xiàn)RAS突變不是持續(xù)激活,而是“hyperactive”?;瘜W(xué)上展示了小分子共價(jià)抑制劑既可以通過親和力驅(qū)動(dòng),也可以是反應(yīng)性驅(qū)動(dòng),為這類藥物的應(yīng)用拓展了空間。但RAS還有太多的未解之謎和挑戰(zhàn),AMG510的成功只是攻克RAS難題的一小步。即使是G12C抑制劑,還有許多未知的東西,給其開發(fā)前景帶來不確定性。由于化合物作用于平衡反應(yīng),可能需要較大劑量,AMG510效果較好的劑量達(dá)到960mg,這對(duì)藥物的安全性要求比較高。另外,腫瘤進(jìn)展各階段的DNA分析發(fā)現(xiàn),KRAS變異在肺腺癌和胰腺癌腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性較小,而在肺鱗癌和腸癌中KRAS變異出現(xiàn)較晚,含有KRAS突變的腫瘤細(xì)胞可能只是其中的一個(gè)“亞克隆”。這預(yù)示RAS變異對(duì)藥物的敏感度可能與腫瘤類型高度有關(guān)。AMG510目前來看在腸癌中的臨床效果比較差,似乎驗(yàn)證了這些基礎(chǔ)研究的結(jié)果。分子靶向藥物出現(xiàn)耐藥被認(rèn)為是難以避免的。AMG510作為KRAS直接抑制劑,剛開始臨床研究,是不是容易耐藥還難以判斷。不過,安進(jìn)公開的臨床數(shù)據(jù)顯示,在15周時(shí)間內(nèi),11名PR病人已有2名發(fā)生疾病進(jìn)展,其中1人死亡。這也許是為什么AMG510一期數(shù)據(jù)公開后,安進(jìn)的股票沒漲反而是下跌?;A(chǔ)研究給出的信號(hào)也不太好。比如,體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)KRAS變異的依賴程度與細(xì)胞的生長(zhǎng)條件高度相關(guān),3D培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)G12C抑制劑的敏感程度大于2D培養(yǎng)。這讓人擔(dān)心腫瘤微環(huán)境的調(diào)整即可輕松擺脫對(duì)KRAS的依賴。2014年的一篇研究報(bào)告顯示,胰腺癌細(xì)胞通過激活Yap1,可以克服對(duì)KRAS依賴。還有就是RAS是否存在二聚或者多聚的情況在學(xué)術(shù)界還有較大爭(zhēng)議,但這也可算作機(jī)制不明確的風(fēng)險(xiǎn)。RAS通路的RAF蛋白就是通過二聚產(chǎn)生抑制劑誘導(dǎo)的反向激活。

    RAS藥物開發(fā)的展望

    首先,考慮靶向其他RAS突變,比如最常見的G12D和G12V。因?yàn)檫@類蛋白缺乏合適的Cys或者其他非天生的可共價(jià)結(jié)合的氨基酸,要取得足夠的活性和選擇性比較困難。BI在今年8月報(bào)道了一個(gè)納摩爾活性的,結(jié)合在Switch區(qū)域的非共價(jià)抑制劑BI-2852。機(jī)制上不同于G12C抑制劑,這個(gè)化合物可以同時(shí)抑制活性和非活性狀態(tài)RAS,且不限于G12C。令人遺憾的是,細(xì)胞測(cè)試上活性不高,而且出現(xiàn)了類似于Braf抑制劑的反向激活的老問題。另外,藥物聯(lián)用是克服耐藥和提高療效的一個(gè)常用辦法。臨床前研究表明,KRAS變異對(duì)腫瘤免疫療法比較敏感,特別是P53共變異的病人。AMG510與PD-1單抗聯(lián)用的臨床研究即將展開,讓我們拭目以待。KRAS抑制劑與RAS通路上其他藥物的聯(lián)用也值得探索,比如EGFR、Braf、MEK、PI3K,以及SHP2抑制劑等。尋找與RAS變異合成致死的藥物,最近的例子有XPO1抑制劑和鐵死亡誘導(dǎo)劑等。隨著新技術(shù)的發(fā)展,人們也將眼光轉(zhuǎn)向了其他非小分子藥物形式,比如siRNA、細(xì)胞內(nèi)單抗碎片等。用于RAS蛋白降解的PROTAC也有不少專利公開。這些研究都是很好的嘗試,但離真正的臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路。比較有意思的是,細(xì)胞治療的權(quán)威Rosenberg最近在NEJM上報(bào)道了一例針對(duì)KRAS G12D的TIL療法。經(jīng)過G12D特異和HLA-C*8:02等位基因限制的T細(xì)胞治療,一個(gè)50歲的帶有肺轉(zhuǎn)移的女性腸癌患者取得了9個(gè)月的PR。然而,HLA-C*8:02的廣泛性如何還有爭(zhēng)議,有專家認(rèn)為非常罕見。

    在新藥難覓的今天,RAS直接抑制劑的突破,哪怕是一小步,也讓人無比欣慰。中國創(chuàng)新藥這兩年經(jīng)歷了比較大的起伏,向原創(chuàng)新藥轉(zhuǎn)型的呼聲日益高漲。KRAS G12C抑制劑的開發(fā)也許能給我們稍許啟示?;A(chǔ)研究確實(shí)是原創(chuàng)新藥的基礎(chǔ),但能否或多長(zhǎng)時(shí)間能導(dǎo)致新藥的發(fā)現(xiàn)卻未可知。RAS從20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn),經(jīng)歷了50多年,其中對(duì)其生物學(xué)有貢獻(xiàn)的基礎(chǔ)研究數(shù)以千計(jì),作為一個(gè)潛在的靶點(diǎn)是十分明了的事情,但直到2013年,Shokat實(shí)驗(yàn)室才找到了第一個(gè)具有成藥性的直接抑制劑。Shokat的大膽嘗試很重要,但我認(rèn)為,突破的關(guān)鍵是其UCSF同事Wells James教授開發(fā)的“Tethering”技術(shù)。這個(gè)技術(shù)在2000年發(fā)表后,一直默默無聞,看似沒有什么用處。這說明藥物創(chuàng)新的生態(tài)環(huán)境多么重要,不是單打獨(dú)斗可以實(shí)現(xiàn)的。從商業(yè)的角度看,Shokat幫助建立的Wellspring公司應(yīng)該是原創(chuàng),但是很快被fast-follow的安進(jìn)公司超越,大概率AMG510將成為第一個(gè)上市的G12C抑制劑。所以,在中國新藥研發(fā)轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵時(shí)期,各方應(yīng)該靜下心來做自己擅長(zhǎng)的事情,無論是基礎(chǔ)研究,仿制還是原創(chuàng),營造藥物創(chuàng)新良好的生態(tài)。真正的原創(chuàng)新藥可能沒有什么路徑,也沒有什么時(shí)間表,事情做好了,就水到渠成了。

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