北大冷凍電鏡全原子動力學(xué)分析進入新階段

文／本刊記者 王 郁

今年1月4號，北京大學(xué)物理學(xué)院人工微結(jié)構(gòu)和介觀物理國家重點實驗室、前沿交叉學(xué)科研究院定量生物學(xué)中心毛有東課題組在《自然》雜志上發(fā)表了題為《底物結(jié)合的人源26S蛋白酶體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)和動力學(xué)》的長論文，通過冷凍電子顯微鏡和機器學(xué)習(xí)技術(shù)的結(jié)合，解析了人源蛋白酶體26S在降解底物過程中的七種中間態(tài)構(gòu)象的高分辨（2.8～3.6埃）精細原子結(jié)構(gòu)，局部分辨率最高達到2.5埃。

這些三維結(jié)構(gòu)展現(xiàn)了驚人的時空連續(xù)性，生動呈現(xiàn)了原子水平的蛋白酶體和底物相互作用的動態(tài)過程，首次實現(xiàn)了對三磷酸腺苷酶（AAA-ATPase）六聚馬達分子內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）水解全周步進循環(huán)完整過程的原子水平觀測和三維建模，發(fā)現(xiàn)三種不同的ATP水解協(xié)同反應(yīng)模式，及其如何調(diào)控蛋白酶體復(fù)雜多樣的功能。

論文解決了一系列長期懸而未決的重要科學(xué)問題：蛋白酶體如何進行泛素識別和去泛素化；三磷酸腺苷酶分子馬達如何打開其軸心通道并與底物結(jié)合；底物轉(zhuǎn)運如何啟動；三磷酸腺苷酶馬達如何將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機械能，進而實現(xiàn)底物解折疊的協(xié)同動力學(xué)機制。

這是《自然》雜志首次發(fā)表系統(tǒng)性、優(yōu)于3.6埃分辨率水平實驗研究超大復(fù)合蛋白質(zhì)機器的動力學(xué)過程和原理的論文，標志冷凍電鏡的發(fā)展開始進入全原子動力學(xué)分析的新“里程”?！蹲匀弧冯s志編輯部和審稿人對該論文的發(fā)表高度重視，從9月12日投稿、審稿到11月12日正式在線發(fā)表，用時僅兩個月時間。

蛋白酶體如何實現(xiàn)底物降解的原子水平工作機制亟待突破

該論文通訊作者、北京大學(xué)教授毛有東介紹，泛素-蛋白酶體體系是細胞內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)降解通路，對維持生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的濃度平衡，以及對調(diào)控蛋白、錯誤折疊或受到損傷的蛋白的快速降解起著至關(guān)重要的作用，參與了細胞周期、基因表達調(diào)控等多種細胞進程，由UPS失常引發(fā)的蛋白質(zhì)新陳代謝異常與眾多人類重大疾病直接相關(guān)。

2004年，Aaron Ciechanover、Irwin Rose和Avram Hershko三位科學(xué)家被授予了諾貝爾化學(xué)獎，以表彰他們對該降解通路的發(fā)現(xiàn)。在該通路的終端由蛋白酶體負責(zé)蛋白質(zhì)的降解，它是細胞中最基本、最重要、最復(fù)雜且不可或缺的大型全酶超分子復(fù)合機器之一，人源蛋白酶體全酶包含至少33種不同的亞基，總分子量約為2.5MDa。

毛有東說，美國FDA批準的多種治療癌癥的藥物分子即以蛋白酶體為直接靶標。近年來，隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，人們對這一大分子機器的結(jié)構(gòu)和功能研究得以不斷深入。2016年，毛有東課題組與合作者報道了人源蛋白酶體基態(tài)的3.6埃冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及其它三個亞納米分辨構(gòu)象，首次發(fā)現(xiàn)了一個亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象的核心顆粒底物轉(zhuǎn)運通道處于開放狀態(tài)。

2018年4月，該課題組又報道了六個ATPγS結(jié)合狀態(tài)下的26S動態(tài)結(jié)構(gòu)，包括三個核心顆粒亞基開放態(tài)對應(yīng)的亞穩(wěn)簡并態(tài)近原子分辨（4～5埃）結(jié)構(gòu)。盡管這些工作揭示了蛋白酶體的基本架構(gòu)和內(nèi)在運動行為，但由于缺乏蛋白酶體與底物之間的相互作用，人們對于蛋白酶體如何實現(xiàn)底物降解的原子水平工作機制仍一無所知。

“此外，盡管冷凍電鏡技術(shù)近年來廣泛應(yīng)用于分析具有動態(tài)特征的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)和平衡態(tài)構(gòu)象，但對其中間態(tài)結(jié)構(gòu)和非平衡構(gòu)象分析的分辨率水平往往局限在4～6?；蚋停x真正的全原子水平動力學(xué)分析還有相當一段距離?！泵袞|說。

完整展示蛋白酶體從泛素結(jié)合到去泛素化再到底物轉(zhuǎn)運的動態(tài)過程

該論文的共同第一作者、原課題組博士后、現(xiàn)為中國科學(xué)院化學(xué)所研究員董原辰博士介紹，為了真正實現(xiàn)原子水平的蛋白酶體底物降解動態(tài)過程的冷凍電鏡三維重建和動力學(xué)表征，課題組攻克了兩大技術(shù)難題。

其一，如何在蛋白酶體完成底物降解之前抓到它所有可能的中間態(tài)構(gòu)象。課題組發(fā)展了一種新穎的三磷酸腺苷（ATP）置換法，利用ATPγS降低三磷酸腺苷酶水解活性的特點，在底物降解中間過程，通過將ATP快速置換成ATPγS，結(jié)合快速冷凍的優(yōu)勢，從而撲捉到蛋白酶體在底物降解過程的中間態(tài)。

其二，在從冷凍電鏡數(shù)據(jù)中分析出更多構(gòu)象的同時，如何把分辨率做到3埃甚至更好。課題組通過多年持續(xù)努力，發(fā)展了多種基于人工智能和機器學(xué)習(xí)的冷凍電鏡圖像聚類的新型算法，并針對蛋白酶體的動力學(xué)特征，設(shè)計了一套極其有效的整合了多種算法的多構(gòu)象分類流程。

董原辰說，通過這兩套技術(shù)方案的完美結(jié)合，課題組成功解析了人源蛋白酶體在降解底物過程中七種不同的、但差別甚微的、高分辨原子水平的天然態(tài)構(gòu)象，完整展示了蛋白酶體從泛素結(jié)合到去泛素化，再到底物轉(zhuǎn)運的動態(tài)過程。與同期在《科學(xué)》發(fā)表的與底物結(jié)合的酵母蛋白酶體的4.2～4.7埃冷凍電鏡結(jié)構(gòu)相比，這篇《自然》論文不僅在總構(gòu)象數(shù)量上多一倍，全部構(gòu)象分辨率還高1～2埃。

由于《科學(xué)》論文采用了抑制Rpn11去泛素活性的策略，其非天然態(tài)結(jié)構(gòu)中底物并不能真正自由轉(zhuǎn)運，所推測的機理僅限于底物轉(zhuǎn)運這一步，對于其它三大《自然》論文所回答重要問題均無法給出答案。這體現(xiàn)了該篇《自然》論文不僅在實驗方法的原創(chuàng)性及數(shù)據(jù)分析水平和質(zhì)量上，還在科學(xué)發(fā)現(xiàn)和問題探究的深度和廣度上大幅超越了來自《科學(xué)》的競爭性論文。

北大冷凍電鏡平臺在數(shù)據(jù)采集效率和成像分辨率等各方面均已達到國際領(lǐng)先水平

該論文的共同第一作者、課題組博士生張書文介紹，作為整個蛋白酶體的動力來源與運轉(zhuǎn)核心，三磷酸腺苷酶分子馬達展現(xiàn)出了三種不同的ATP水解協(xié)作模式，六個三磷酸腺苷酶亞基協(xié)調(diào)工作，交替與底物發(fā)生相互作用。在去泛素化過程中，處于對立位置的兩個三磷酸腺苷酶亞基Rpt2與Rpt4水解ATP，而Rpt5與Rpt6則釋放ADP，三磷酸腺苷酶內(nèi)的底物轉(zhuǎn)運通道被打開，使得底物可以進入軸心通道。

與此同時，去泛素化酶Rpn11亞基與泛素及底物發(fā)生相互作用，執(zhí)行其作為去泛素化酶的功能；在轉(zhuǎn)運起始過程中，相鄰的兩個三磷酸腺苷酶亞基Rpt1與Rpt5同時水解ATP，調(diào)控顆粒發(fā)生大規(guī)模轉(zhuǎn)動并釋放泛素；在底物去折疊與轉(zhuǎn)運過程中，三個相鄰的三磷酸腺苷酶亞基會分別同步進行ATP的結(jié)合、ADP的釋放與ATP的水解，這一過程會單向傳遞下去，將ATP水解釋放的化學(xué)能轉(zhuǎn)換為機械能，使得相應(yīng)的三磷酸腺苷酶亞基發(fā)生剛體轉(zhuǎn)動，推動底物的去折疊和單向輸運，同時核心顆粒亞基的轉(zhuǎn)運通道入口打開，底物被送入通道中進行降解。

毛有東說，這些研究結(jié)果為幾十年來對蛋白酶體功能的研究提供了寶貴的第一手原子結(jié)構(gòu)和動力學(xué)信息，對于理解生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解過程和一系列負責(zé)物質(zhì)輸運的三磷酸腺苷酶馬達分子的一般工作原理具有極為重要的科學(xué)意義。

記者了解到，北京大學(xué)物理學(xué)院人工微結(jié)構(gòu)和介觀物理國家重點實驗室為這篇論文的第一完成單位，該研究工作的全部冷凍電鏡數(shù)據(jù)均在北京大學(xué)電子顯微鏡實驗室和北大冷凍電鏡平臺完成采集，大部分數(shù)據(jù)分析工作在北大高性能計算平臺上完成。論文的發(fā)表標志著北大冷凍電鏡平臺建設(shè)后來居上，在數(shù)據(jù)采集效率和成像分辨率等各方面均已達到國際領(lǐng)先水平，具備了相當?shù)膰H競爭力。同時，這項研究得到國家自然科學(xué)基金委、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、美國Intel公司并行計算研究基金、美國國家健康研究院的資助。