安徽省玉米穗腐病主要致病鐮孢菌的分離與鑒定

魏琪 廖露露 陳莉

摘要 為明確安徽省玉米穗腐病主要致病鐮孢菌的種類，采用單孢分離、形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定的方法，對2017年采集自安徽省6個(gè)玉米主產(chǎn)區(qū)——合肥市、蚌埠市、淮北市、阜陽市、亳州市和宿州市的玉米穗腐病病樣進(jìn)行了分離鑒定。在獲得的455株鐮孢菌中，擬輪枝鐮孢菌、禾谷鐮孢復(fù)合種、層出鐮孢菌、尖孢鐮孢菌和黃色鐮孢菌的分離頻率分別為59.13%、21.28%、13.68%、5.12%和0.79%。其中擬輪枝鐮孢菌在各地的分布最廣，屬于安徽省的優(yōu)勢致病鐮孢菌。

關(guān)鍵詞 玉米; 穗腐病; 鐮孢菌

中圖分類號： S 435.131 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018362

Abstract In order to clarify the major pathogenic Fusarium species of maize ear rot in Anhui province， the samples were collected from six main maize regions of Hefei， Bengbu， Huaibei， Fuyang， Bozhou and Suzhou in 2017， and the pathogen was isolated and identified by single spore isolation， morphological and molecular identification. Among the 455 isolates of Fusarium， the isolation frequencies of Fusarium verticillioides，F(xiàn).graminearum species complex， F.proliferatum， F.oxysporum and F.culmorum were 59.13%， 21.28%， 13.68%， 5.12% and 0.79%， respectively. The results showed that F.verticillioides was the most widely distributed and was the main pathogenic Fusarium species in Anhui province.

Key words maize; ear rot; Fusarium spp.

玉米是我國重要的糧食作物，同時(shí)也是重要的工業(yè)原料和畜牧飼料，而玉米穗腐病一直是玉米生產(chǎn)上的重要病害。玉米穗腐病由多種病原菌侵染引起。有研究表明，在我國引起玉米穗腐病的主要致病菌為鐮孢菌，其次還有青霉、曲霉、木霉等，其中擬輪枝鐮孢Fusarium verticillioides和禾谷鐮孢復(fù)合種F.graminearum species complex為廣泛分布的優(yōu)勢致病種類[1]。由于地理位置、氣候條件等的不同，各地引起玉米穗腐病的鐮孢菌種類也有所不同。重慶地區(qū)玉米穗腐病優(yōu)勢致病鐮孢菌為擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢復(fù)合種和層出鐮孢[2]。甘肅省和遼寧省的優(yōu)勢致病鐮孢菌為擬輪枝鐮孢[3-4]。黃淮海夏玉米主產(chǎn)區(qū)玉米穗腐病優(yōu)勢病原菌為擬輪枝鐮孢、禾谷鐮孢復(fù)合種和木霉[5]。目前，尚未見有關(guān)安徽省玉米穗腐病主要致病鐮孢菌的系統(tǒng)報(bào)道。因此本試驗(yàn)從安徽省主要玉米生產(chǎn)區(qū)采集病樣，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對致病鐮孢菌進(jìn)行分離鑒定，為安徽省玉米穗腐病的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米穗腐病病樣的采集：2017年從安徽省6個(gè)玉米主產(chǎn)區(qū)——合肥市、蚌埠市、淮北市、阜陽市、亳州市和宿州市共采集玉米穗腐病病樣226份，所有病樣均用紙袋包好帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離鑒定。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar， PDA）培養(yǎng)基;合成低營養(yǎng)瓊脂（spezieller nhrstoffarmer agar， SNA）培養(yǎng)基;水瓊脂（water agar， WA）培養(yǎng)基。

試劑：2×Taq Plus Master Mix、100 bp Plus DNA Ladder、5 U Taq DNA聚合酶、10×Buffer、2.5 mmol/L dNTPs，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;鐮孢屬/種的特異性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 玉米穗腐鐮孢菌的單孢分離

從發(fā)病玉米穗上隨機(jī)挑取30個(gè)籽粒，置于3% NaClO溶液中，浸泡消毒2 min，再放入75%乙醇中停留10 s，快速取出放入無菌水中清洗，置于滅菌濾紙上吸干水分。隨機(jī)夾取玉米籽粒均勻放置在加有鏈霉素的PDA平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待籽粒周圍長出菌絲后，挑取菌絲置于新的PDA平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，4～7 d后觀察形態(tài)。將疑似鐮孢菌的菌株進(jìn)行單孢分離，挑取部分菌絲置于1.0 mL無菌水中，通過連續(xù)稀釋，配制成終濃度為1個(gè)/μL的孢子懸浮液，吸取30 μL于SNA平板上，均勻涂板，置于25℃下培養(yǎng)48 h，挑取單菌落于新的SNA平板上再培養(yǎng)4～5 d，即獲得單孢純培養(yǎng)菌株[6]。鐮孢菌分離頻率的計(jì)算公式如下：

各屬真菌的分離頻率=攜帶各屬真菌的玉米籽粒數(shù)/總玉米籽粒數(shù)×100%;

各種鐮孢菌分離頻率=同種鐮孢菌株數(shù)/鐮孢菌總株數(shù)×100%。

1.2.2 玉米穗腐鐮孢菌的鑒定

將單孢純培養(yǎng)的菌株分別接種到加有抗生素的PDA和SNA平板上，4 d后測量菌落直徑并計(jì)算生長速率，7 d后觀察菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、顏色變化以及在SNA培養(yǎng)基上的孢子形態(tài)、大小、著生方式等特點(diǎn)。參考Booth和Leslie等的鐮孢菌形態(tài)學(xué)鑒定方法[7-8]，初步確定鐮孢菌的種類。

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）