某豬場(chǎng)豬瘟和圓環(huán)病毒2型混合感染的診斷與防治

李麗娜

某豬場(chǎng)豬瘟和圓環(huán)病毒2型混合感染的診斷與防治

李麗娜

（山東省萊陽市動(dòng)物疫病與控制中心 265200）

豬瘟病毒和圓環(huán)病毒2型是當(dāng)前嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，豬瘟以高發(fā)病率和高死亡率著稱，圓環(huán)病毒2型感染后會(huì)引起PMWS、PDNS等疾病，還會(huì)侵害豬的免疫系統(tǒng)，降低豬體對(duì)各種疾病的抵抗力。

豬瘟俗稱"爛腸瘟"，是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染傳染病。可表現(xiàn)為急性、亞急性、慢性、不典型或不顯癥狀的病程。具有高度傳染性和致死性。本病在自然條件下只感染豬，不同年齡、性別、品種的豬和野豬都易感，一年四季均可發(fā)生。豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，病毒粒子大小為14~25nm，無囊膜，基因組為單股環(huán)狀DNA，嚴(yán)重侵害豬的免疫系統(tǒng)，病毒與巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、組織細(xì)胞和胸腺巨噬細(xì)胞相伴隨，導(dǎo)致患豬體況下降，形成免疫抑制。臨床癥狀最常見的是豬只漸進(jìn)性消瘦或生長遲緩，其他癥狀有厭食、精神沉郁、行動(dòng)遲緩、皮膚蒼白、被毛蓬亂、呼吸困難，咳嗽為特征的呼吸障礙。

2018年11月份，山東禹城某養(yǎng)豬場(chǎng)自繁自養(yǎng)，母豬存欄量100頭的養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疫情，保育舍300頭存欄，部分保育舍豬出現(xiàn)體溫升高至41~42℃，食欲減少，沉郁，眼、鼻黏膜充血，極度衰弱。發(fā)病豬不食、精神差、喜臥、弓背、寒戰(zhàn)等癥狀外，其他典型癥狀有眼結(jié)膜發(fā)炎，有膿性分泌物，有時(shí)可見眼結(jié)膜小點(diǎn)出血。鼻黏膜發(fā)炎，有膿性分泌物。病初便秘，糞便發(fā)黑，如算盤珠子。病后期腹瀉、惡臭、糞帶黏液或血。在病豬鼻端、耳后、腹部、四肢內(nèi)側(cè)等皮薄毛稀處可見大小不等的紫紅色斑點(diǎn)，指壓不褪色；有的豬只漸進(jìn)性消瘦，皮膚蒼白、被毛蓬亂、呼吸困難。一般發(fā)病后5~7d死亡，發(fā)病率達(dá)到60%，死亡率50%以上。使用多種抗生素藥物治療均無效。懷疑該豬場(chǎng)同時(shí)感染了豬瘟病毒和圓環(huán)病毒。為了對(duì)該豬場(chǎng)病情進(jìn)行確診，本研究對(duì)疑似病例進(jìn)行了病理解剖、RT-PCR/PCR基因組核酸檢測(cè)，對(duì)感染豬病原做出了準(zhǔn)確判斷，為及時(shí)采取針對(duì)性的緊急防疫和對(duì)癥用藥提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病理剖檢和樣品采集

對(duì)2例病死豬進(jìn)行解剖，觀察豬內(nèi)臟器官如淋巴結(jié)、肺、脾、腎、喉頭和氣管的病理變化。分別采集病豬的扁桃體、淋巴結(jié)、腎、脾、肺組織各少許，-20℃低溫保存?zhèn)溆?。同時(shí)采集2頭發(fā)病活豬的血液2ml，2000rpm離心取血清冷凍保存。

1.2 材料和試劑

CSFV和PCV2陽性對(duì)照由本實(shí)驗(yàn)室保存；RT-PCR/PCR一步法試劑盒、凝膠回收試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；PTC-2000型PCR儀購自美國MJ Research公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

1.3.1 CSFV引物設(shè)計(jì)與合成 CSFV引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增片段大小為250bp。引物序列為F：5’-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3’，R：5’-GAT TCAACTCCATGTGCCATG-3’。

1.3.2 PCV2引物設(shè)計(jì)與合成 PCV2引物引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增片段大小為721bp。引物序列為F：5’-CAACAGCATGCCCAGCAAGAAGAAT-3’，R：5’-TAGATTACACAGTCTCAGTAG-3’。

1.4 樣品的處理與DNA/RNA提取

取2g左右的病料于研磨器中剪碎并研磨，加入適量的PBS研磨混勻后放入1.5ml離心管中-20℃反復(fù)凍融3次，5000rpm4℃離心2min；取250ml上清放入另一個(gè)1.5ml離心管中，加入750ml Trizol和200ml氯仿，震蕩混勻，-20℃靜置5min，12000rpm 4℃離心15min；取500ml上清加入等量的異丙醇，顛倒數(shù)次，-20℃靜置20min，12000rpm 4℃離心15min，倒掉上清，收集沉淀；75%酒精1ml洗滌沉淀，吸凈水，干燥，加入20ml滅菌水溶解沉淀即為樣品DNA/RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR/RT-PCR擴(kuò)增

（1）利用一步法RT-PCR對(duì)CSFV核酸進(jìn)行檢測(cè)，具體操作如下：反應(yīng)體系為25ml，其中：2× One Step PrimeScript? III RT-qPCR Mix12.5ml，上、下游引物F、R(10mmol/L)各1ml，RNA模板3ml，RNase-free ddH2O 7.5ml。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 30min(反轉(zhuǎn)錄)，95℃ 2min(預(yù)變性)；94℃ 1min(變性)，52℃ 1min(退火)，72℃ 1min(延伸)，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行條帶檢測(cè)。（2）利用PCR對(duì)PCV2核酸進(jìn)行檢測(cè)，具體操作如下：反應(yīng)體系為25ml，其中：2×PCR Master mix 12.5ml，上、下游引物F、R(10mmol/L)各1ml，DNA模板3ml，RNase-free ddH2O 7.5ml。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3min(預(yù)變性)；94℃ 40s(變性)，55℃ 40s(退火)，72℃ 40s(延伸)，重復(fù)35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行條帶檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢

解剖該豬場(chǎng)送檢的2例病死豬，發(fā)現(xiàn)以下病理變化：喉頭出血嚴(yán)重；下頜和腹股溝淋巴結(jié)腫大出血，切面呈大理石花紋樣；肺有一病例汽腫或萎縮出血，尖頁處有肉變現(xiàn)象，顏色發(fā)白；脾臟邊緣出現(xiàn)多處黑色梗死；腎臟出血嚴(yán)重，成麻雀蛋樣，貧血發(fā)黃；腸系膜淋巴結(jié)腫大；膀胱粘膜散布點(diǎn)狀出血。根據(jù)剖檢的病理變化可以初步判斷為這兩例病死豬為豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型感染，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)行確診。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

采集的兩例病料提取RNA后，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，兩例病料樣品都有一條272bp的特異DNA片段，與目的片段大小一致(圖1)，且為強(qiáng)陽性。說明所檢的兩個(gè)樣品為CSFV陽性(表1)。

表1 采用RT-PCR方法對(duì)豬瘟病毒的抗原檢測(cè)結(jié)果

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

采集的兩例病料提DNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，病料1樣品有一條648bp的特異DNA片段，與目的片段大小一致(圖2)，且為強(qiáng)陽性。說明所檢的病料1樣品為PCV2陽性(表2)。

表2 采用PCR方法對(duì)豬II型圓環(huán)病毒的抗原檢測(cè)結(jié)果

圖1 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.4 結(jié)果判定

通過病理解剖、PCR和RT-PCR對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)后，確診該豬場(chǎng)病死豬為豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型混合感染。

3 討論

（1）對(duì)豬瘟的診斷，在臨床上可以通過該病的臨床癥狀和病理解剖做出初步的診斷。如果該豬群再混合感染其他一些疾病，就很難通過肉眼的觀察來診斷該豬群的疾病發(fā)生情況。而且近幾年來豬瘟的流行情況和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，呈多樣性、非典型性，這就使豬瘟在臨床病變上沒有明顯的和非常典型的病變。在加上其他疾病的侵?jǐn)_，給豬病的臨床診斷帶來了不小的麻煩。所以如需準(zhǔn)確的診斷還需要通過實(shí)驗(yàn)室手段。目前實(shí)驗(yàn)室多采用一步法PCR/RT-PCR法快速進(jìn)行檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，還能最大限度的減少了操作過程中污染和假陽性情況的出現(xiàn)。（2）本研究采用臨床剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，對(duì)該豬群豬瘟病毒和圓環(huán)病毒2型的疑似病例進(jìn)行了準(zhǔn)確的診斷，并指導(dǎo)該豬場(chǎng)采取相應(yīng)的有效措施對(duì)全群豬進(jìn)行防治。全群保育豬緊急免疫豬瘟細(xì)胞苗，2頭份/頭，一周后再注射圓環(huán)病毒II型疫苗1頭份/頭。同時(shí)為了防止豬群保育豬繼發(fā)感染其他細(xì)菌病，在其飼料中添加30%的阿莫西林(250g/t飼料)和黃芪多糖提取物(500g/t飼料)。對(duì)發(fā)病比較嚴(yán)重的個(gè)體按照體重注射頭孢噻呋鈉和黃芪多糖注射液，連續(xù)注射3~5d。全群保育豬飲水中加入維生素C和電解多維，連續(xù)飲水1周，較少由于疾病和注射疫苗對(duì)豬體造成的應(yīng)激。（3）對(duì)病死豬及時(shí)進(jìn)行深埋或無害化處理，嚴(yán)格控制發(fā)病豬的流動(dòng)，防治疫情進(jìn)一步擴(kuò)散。保持飼養(yǎng)工具的潔凈，加強(qiáng)通風(fēng)，改善豬舍飼養(yǎng)環(huán)境。進(jìn)行嚴(yán)格消毒制度，對(duì)全場(chǎng)用具、飼養(yǎng)環(huán)境和周圍環(huán)境消毒，每兩周一次環(huán)境大消毒，每周兩次帶豬消毒。

由于診斷及時(shí)準(zhǔn)確，并為其提供了一套系統(tǒng)的防治措施，在嚴(yán)格提供的防治措施執(zhí)行后疫情的到了有效的控制，3d后豬群不再有死亡個(gè)體，采食量有所增加。10d后豬群的采食量和疫情都控制住。

（2019–08–18）

S858.28

B

1007-1733(2019)11-0036-03