綿羊GTF2A1 基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

狄 冉，劉秋月，王翔宇，胡文萍，夏 青，馬 琳，張效生，張金龍，張仁森，潘章源，儲(chǔ)明星

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

綿羊（Ovis Aries）是最早被人類馴化的家畜物種之一。綿羊?yàn)槿祟愄峁┝藘?yōu)質(zhì)肉、奶、毛和皮，因此是一個(gè)重要的家畜物種。對(duì)于綿羊而言，產(chǎn)羔數(shù)性狀是其重要經(jīng)濟(jì)性狀中所占權(quán)重最大的生產(chǎn)性狀，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的貢獻(xiàn)可以達(dá)到74%～96%。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，產(chǎn)雙羔所獲的經(jīng)濟(jì)效益是產(chǎn)單羔的1.6 倍以上[1]。然而，大多數(shù)綿羊?qū)僖惶胃崞贩N，為了提高經(jīng)濟(jì)效益，多羔一直是人們追求的育種目標(biāo)。由于羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的遺傳力僅為0.1左右，對(duì)其選擇還受到性別（限性性狀）等因素的制約，故用常規(guī)育種技術(shù)改良該性狀很難在短期內(nèi)獲得較大的遺傳進(jìn)展。因此，挖掘多羔關(guān)鍵基因、開發(fā)分子標(biāo)記并用于標(biāo)記輔助育種是加快遺傳進(jìn)展的重要舉措。

產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)極其復(fù)雜的性狀，受到遺傳背景、營(yíng)養(yǎng)水平、飼養(yǎng)環(huán)境等多種因素的影響，其中遺傳因素最為重要。目前在中國(guó)綿羊品種中鑒定到的多羔基因主要是FecB[2-7]。雖然FecB基因型在一些品種例如小尾寒羊中是分離的，但在不攜帶FecB突變的小尾寒羊中仍然能夠觀測(cè)到連續(xù)的高產(chǎn)羔數(shù)現(xiàn)象，這表明我國(guó)綿羊中很可能還存在其他多羔主效基因。

全基因組選擇信號(hào)分析是目前挖掘功能基因的一種重要的方法[8-14]。本團(tuán)隊(duì)前期通過對(duì)10 個(gè)綿羊品種（按照單、多羔進(jìn)行分組）的全基因組重測(cè)序，定義Z（Fst）>5 為顯著位點(diǎn)，篩選獲得了可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因——通用轉(zhuǎn)錄因子2A1（GTF2A1，General transcription factor 2A1）及其突變位點(diǎn)（7 號(hào)染色體基因組序列第89505005bp 位點(diǎn)，位于內(nèi)含子區(qū)域），其Z（Fst）值為6.37，提示該基因可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)。該基因是與RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄引發(fā)所需的TFIID-啟動(dòng)子復(fù)合物相互作用的一種轉(zhuǎn)錄因子[15]。Lawal 等[16]利用紅色原雞作對(duì)照，分析了非洲地方雞品種可能受選擇的基因組區(qū)域，其中只有1 個(gè)區(qū)域存在注釋基因（TSHR和GTF2A1），作者認(rèn)為這些受選擇的基因可能與雞種適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件、繁殖等性狀相關(guān)。Yuan 等[17]利用白來航和東鄉(xiāng)綠殼雞雜交產(chǎn)生的1 534 只F2代母雞進(jìn)行產(chǎn)蛋性狀的GWAS 分析，發(fā)現(xiàn)GTF2A1和CLSPN基因影響了母雞卵巢和子宮的功能，二者可能是產(chǎn)蛋的候選基因。Huang 等[18]報(bào)道GTF2A1基因在卵巢癌患者的病灶中是高度甲基化的，該基因可作為卵巢癌檢測(cè)的一個(gè)分子標(biāo)記。Lee 等[19]的研究結(jié)果認(rèn)為GTF2A1與白血病相關(guān)的IL1B-31C 基因互作從而引發(fā)胃癌風(fēng)險(xiǎn)。然而目前未見GTF2A1與羊多羔性狀有關(guān)的報(bào)道。因此，本研究以多羔和單羔的綿羊群體及產(chǎn)羔數(shù)存在差異的小尾寒羊大群為研究對(duì)象，利用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)進(jìn)行SNP 分型檢測(cè)，分析GTF2A1基因上述突變位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)系，以期為綿羊高繁殖力性狀的標(biāo)記輔助選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 具有產(chǎn)羔數(shù)記錄的多羔綿羊品種小尾寒羊380 只（來自同一個(gè)保種場(chǎng)同一個(gè)群體，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，年齡均為2～3 歲），記錄產(chǎn)羔數(shù)均為1 的綿羊群體（灘羊、蘇尼特羊、薩?？搜?、杜泊羊和草原型藏羊）共380 只（具體數(shù)量見表1）。飼養(yǎng)管理?xiàng)l件基本一致。

1.2 試劑及儀器 試劑：血液基因組DNA 提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；Complete Genotyping Reagent Kit（for MassARRAY?Compact 384），購自北京君諾德生物技術(shù)有限公司（Beijing Genenode Biotech Co,Ltd）。儀器包括基因擴(kuò)增：ABI GeneAmp?9700 384 Dual；質(zhì)譜點(diǎn)樣：MassARRAY NanodispenserRS1000；質(zhì)譜分析：MassARRAY Compact System。

1.3 基因組DNA 的提取 綿羊頸靜脈采血1 mL，用EDTA 抗凝處理。使用天根血液DNA 試劑盒提取DNA，并進(jìn)行DNA 濃度和質(zhì)量檢測(cè)。

1.4 采用Sequenom MassARRAY?SNP 技術(shù)進(jìn)行基因分型 針對(duì)綿羊第7 號(hào)染色體基因組序列第89505005 bp位點(diǎn)（基于綿羊基因組版本號(hào)Oar_v3.1）設(shè)計(jì)引物組。PCR 擴(kuò)增使用的上游引物序列為：ACGTTGGATGATG AAATCCATCTACCGCCC；下游引物序列為：ACGTT GGATGATCCCCATGTCCAGATCTTC。延伸引物序列為：GCATTAGTTTATTCTCCCATAACT，延伸方向是正向。上述引物由君諾德公司合成。將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384 孔SpectroCHIP（Sequenom）芯片上，進(jìn)行MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）反應(yīng)，利用Typer 4.0 軟件檢測(cè)質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本目標(biāo)位點(diǎn)基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用Microsoft Excel 2016 軟件統(tǒng)計(jì)綿羊GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率、雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）和有效等位基因數(shù)（Ne）等指標(biāo)，隨后進(jìn)行Hardy-Weinberg 檢測(cè)。使用yijkl=μ+Pj+Gk+eijkl 模型進(jìn)行最小二乘方差分析，其中，yijkl 為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值；μ 為群體平均值；Pj 為第j 個(gè)胎次的固定效應(yīng)，j=1,2,3；Gk 為該基因第k 種基因型的固定效應(yīng)，k=1,2,3；eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)；誤差項(xiàng)e 服從正態(tài)分布N（0,σ2）。用SPSS19.0 軟件程序中一般線性模型進(jìn)行小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

表1 被測(cè)綿羊品種及個(gè)體數(shù)量信息

2 結(jié)果與分析

2.1GTF2A1基因多態(tài)性分析 通過基因分型發(fā)現(xiàn)，GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)在單、多羔綿羊品種中均存在3 種基因型：AA、AG 和GG（圖1）。

圖1 綿羊GTF2A1 基因g.89505005G>A 位點(diǎn)分型結(jié)果圖

根據(jù)g.89505005G>A 位點(diǎn)分型結(jié)果，統(tǒng)計(jì)單、多羔綿羊品種中該位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，由表1 可知，綿羊g.89505005G>A 位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在單、多羔綿羊群體間差異均達(dá)到極顯著水平，且多羔群體的優(yōu)勢(shì)基因型為AA，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳；單羔群體的優(yōu)勢(shì)基因型為GG，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚。

對(duì)GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由表2 和表3 可知，綿羊GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和草原藏羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25≤PIC＜0.5），在杜泊羊和薩福克羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)在所有6 個(gè)被測(cè)品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P>0.05）。針對(duì)該位點(diǎn)，灘羊、蘇尼特羊和草原藏羊的遺傳多樣性較高，其雜合度和有效等位基因數(shù)數(shù)值高于其他3 個(gè)品種數(shù)值。

2.2GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 將GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)基因型與小尾寒羊第1 胎、第2 胎和第3 胎產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，表4 的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，針對(duì)所有3 胎數(shù)據(jù)，AA 型的母羊產(chǎn)羔數(shù)均顯著高于GG 型母羊。

3 討 論

3.1GTF2A1基因與動(dòng)物繁殖性能的關(guān)系 Lawal 等[16]利用紅色原雞為對(duì)照，分析了非洲埃塞俄比亞地區(qū)地方雞品種可能受選擇的基因組區(qū)域，發(fā)現(xiàn)Z（Hp）最低值（-5.8 ± 0.289）位于5 號(hào)染色體上涵蓋注釋基因（TSHR和GTF2A1）的區(qū)域，而且這個(gè)區(qū)域在多個(gè)地方雞種中均存在選擇信號(hào)，作者認(rèn)為這些受選擇的基因可能與雞種適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件、繁殖等性狀相關(guān)。Yuan 等[17]利用白來航和東鄉(xiāng)綠殼雞雜交產(chǎn)生的1 534 只F2代母雞進(jìn)行產(chǎn)蛋性狀的GWAS 分析，發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)蛋數(shù)最顯著關(guān)聯(lián)的區(qū)域包含了GTF2A1和STON2基因，值得注意的是兩者是旁系同源基因；另外，作者推測(cè)GTF2A1和CLSPN基因通過影響母雞卵巢和子宮的功能進(jìn)一步調(diào)控產(chǎn)蛋性能。Huang 等[18]報(bào)道GTF2A1基因在卵巢癌患者的病灶中是高度甲基化的，該基因可作為卵巢癌檢測(cè)的一個(gè)分子標(biāo)記。在綿羊中，GTF2A1基因位于7號(hào)染色體上，與TSHR和STON2基因相鄰，已有很多文獻(xiàn)表明TSHR與動(dòng)物繁殖性能相關(guān)[20-22]，因此這個(gè)區(qū)域值得關(guān)注。本課題前期的重測(cè)序分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)GTF2A1基因在多羔品種中受到了強(qiáng)烈選擇，暗示這個(gè)基因可能與綿羊繁殖性能有關(guān)聯(lián)。

3.2GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)多態(tài)性及其與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系 群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和草原藏羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)，在杜泊羊和薩?？搜蛑斜憩F(xiàn)為低度多態(tài)，表明該位點(diǎn)在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和草原藏羊中存在較強(qiáng)的選擇潛力。另外，本課題對(duì)GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析表明兩者存在一定關(guān)聯(lián)，A 等位基因可能是提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的一個(gè)潛在有效的DNA 標(biāo)記。

表2 GTF2A1 基因g.89505005G>A 位點(diǎn)在單、多羔綿羊群體中的基因型頻率和等位基因頻率

表3 GTF2A1 基因g.89505005G>A 位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

表4 GTF2A1 基因g.89505005G>A 位點(diǎn)基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

4 結(jié) 論

綿羊GTF2A1基因g.89505005G>A 位點(diǎn)多態(tài)性與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)存在一定關(guān)聯(lián)，A 等位基因可能是提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的一個(gè)潛在有效的DNA 標(biāo)記。