對屠宰場非洲豬瘟檢測的幾點思考

文│吳日鈞（江蘇省海安市曲塘鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站）

按照《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于加強(qiáng)屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟檢測工作的通知》（農(nóng)牧發(fā)[2019]7號）和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部119號公告要求，即使是年屠宰量5萬頭以下的屠宰場（企業(yè)）也不得遲于2019年7月1日前全部實現(xiàn)非洲豬瘟自檢；駐場官方獸醫(yī)必須要監(jiān)督生豬屠宰場（企業(yè)）按照 “批批檢，全覆蓋” 的原則全面開展非洲豬瘟檢測，不得遺漏任何一批次生豬的檢測。

屠宰環(huán)節(jié)是連接生豬產(chǎn)銷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在屠宰環(huán)節(jié)實施非洲豬瘟自檢制度，而不是在生豬產(chǎn)地養(yǎng)殖場戶實施，能以最小人力、經(jīng)濟(jì)成本來取得最大控制、切斷病毒傳播途徑的效果；而在屠宰場，容易采集樣品，容易結(jié)合臨床和剖檢情況判斷，能夠及時發(fā)現(xiàn)并且開展追溯，及時消除隱患；還能夠嚴(yán)防染疫生豬產(chǎn)品進(jìn)入食品加工流通環(huán)節(jié)，消除消費者對食用豬肉的擔(dān)憂，扶持養(yǎng)豬戶的積極性，保護(hù)生豬健康發(fā)展。

屠宰場（企業(yè)）開展非洲豬瘟自檢，對屠宰場（企業(yè)）實驗室環(huán)境、技術(shù)人員、儀器設(shè)備和檢測試劑都有著高標(biāo)準(zhǔn)要求。要建設(shè)符合標(biāo)準(zhǔn)的病毒核酸（熒光PCR）檢測實驗室，并配備非洲豬瘟熒光PCR檢測技術(shù)人員，按程序步驟規(guī)范操作處理。當(dāng)前，學(xué)習(xí)提高非洲豬瘟的檢測技術(shù)成為屠宰場（企業(yè)）檢測、復(fù)核、監(jiān)督等人員的必修課。

為做好屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）工作，參考《非洲豬瘟診斷技術(shù)》（GB/T 18648-2002），筆者有以下幾點思考：

一、確保樣品來源規(guī)范采集

在確保全覆蓋的前提下， 可以進(jìn)行入場前檢測，即在生豬進(jìn)場前，以車為單位，采集全部生豬血液樣品，均勻混合后進(jìn)行檢測。每車生豬采集血液后檢測時抽取血液體積數(shù)量要一致；有的地方實行每份混合血液來源的生豬數(shù)量要控制在50頭以下，即生豬數(shù)量每50頭或者不足50頭時，做1份混合血液的非洲豬瘟檢測。具體混樣生豬數(shù)量可根據(jù)所使用的檢測試劑盒的技術(shù)指標(biāo)科學(xué)確定。采集時，最好選擇瘦弱的生豬作為采集對象，以便更好發(fā)現(xiàn) “問題豬”，發(fā)現(xiàn)后盡早按規(guī)定處理。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)對生豬屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟檢測有關(guān)要求進(jìn)行了補充，即按照農(nóng)牧便函[2019]606號要求，生豬屠宰場（企業(yè)）要按照 “頭頭采、批批檢、全覆蓋” 的原則，對每一頭待宰生豬都要采集其血液樣品；若選擇在生豬進(jìn)入屠宰場（企業(yè)）前進(jìn)行采樣的，也必須對每一頭擬進(jìn)廠（場）生豬進(jìn)行采血，做到抽樣全覆蓋。若同批豬中有病死豬，應(yīng)優(yōu)先采集病死豬的脾臟、淋巴結(jié)等組織病料開展實驗室檢測。將采好豬血的注射器或者采血管在室溫下傾斜靜置2～4小時（防止暴曬），或者置于37℃溫箱內(nèi)1小時，待大部分血清析出后，取出血清，必要時離心分離血清（最低建議量為5毫升）。

樣品的采集、運輸與保存應(yīng)當(dāng)符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實施方案（2019版）》的要求。

二、確保診斷試劑可靠和操作規(guī)范科學(xué)

嚴(yán)格非洲豬瘟病毒診斷試劑質(zhì)量和檢測操作程序。要考慮試劑是否可靠穩(wěn)定，操作是否規(guī)范科學(xué)。

要使用經(jīng)過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)或者經(jīng)過中國動物疫病預(yù)防控制中心比對符合要求的檢測方法和檢測試劑盒。要強(qiáng)化檢測技術(shù)保障，細(xì)化檢測標(biāo)準(zhǔn)和查找程序。要按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部154號公告中的檢驗試行規(guī)程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等執(zhí)行。

陽性對照的Ct值＜30且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線；陰性對照應(yīng)無Ct值或者Ct值≥40且無特異性擴(kuò)增曲線，線形為直線或者輕微斜線，無指數(shù)增長期。試驗結(jié)果才有效；否則應(yīng)該重新進(jìn)行試驗。

被檢樣品Ct值應(yīng)＜40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為陽性；當(dāng)無Ct值或者Ct值≥40，判為陰性。

PCR檢測的每一步都應(yīng)在專門區(qū)域或者地點進(jìn)行；使用前應(yīng)該將熒光PCR預(yù)混液、陰性對照和陽性對照完全融化，充分振蕩混勻，瞬時離心，盡量吸取液體上層；試劑盒不同組分間不得交叉，樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋，避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性；樣品、凍存試劑要避免反復(fù)凍融。

凡每一個步驟要吸取轉(zhuǎn)移樣品時均應(yīng)該更換一個移液器吸頭（槍頭）。

在操作過程中對時間、試劑體積等精確控制可以獲得最佳的效果；特別用移液器吸取幾微升的液體時，吸取時要足量，轉(zhuǎn)移注入時要徹底注入，因為本來轉(zhuǎn)移的液體就是微量，不能有一點點出入。

檢測過程中應(yīng)該使用不帶熒光物質(zhì)的一次性乳膠手套。

三、保證檢測數(shù)據(jù)真實可靠

每次檢測時， 必須要設(shè)立陰性對照和陽性對照，不可為降低檢測成本而省略此步驟；對檢測中的陰性對照和陽性對照閾值數(shù)據(jù)，要定期比對、校對；確定檢測儀器、熒光PCR儀（包括配備的便攜式電腦）、器材等是否需要維護(hù)保養(yǎng)。要保證檢測結(jié)果的真實可靠、準(zhǔn)確科學(xué)，必須如實記錄檢測結(jié)果。

四、檢測臺賬是否完整

要完整詳細(xì)原始保留檢測報告和臺賬，不得涂改，中間各項不得漏缺。

五、加強(qiáng)屠宰場實驗室內(nèi)部管理

屠宰場（企業(yè)）的實驗室建設(shè)可以參考河南省非洲豬瘟疫情防控工作應(yīng)急指揮部制定的《生豬養(yǎng)殖屠宰及加工環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒核酸檢測實驗室建設(shè)技術(shù)指南》中的標(biāo)準(zhǔn)要求，屠宰場（企業(yè)）實驗室分設(shè)掛、貼有明確標(biāo)識的更衣室、樣品處理室、試劑配置區(qū)、核酸提取區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)、無害化處理室，并配備適用的消防等應(yīng)急器材。屠宰場實驗室制定并嚴(yán)格落實生物安全管理、安全防護(hù)、感染控制和生物安全應(yīng)急預(yù)案等規(guī)章制度。

實驗室要進(jìn)行消毒效果的評估，使其嚴(yán)格消毒程序，強(qiáng)化消毒工作，達(dá)到有效消毒目的。屠宰企業(yè)建設(shè)符合PCR檢測技術(shù)要求的實驗室，檢測試劑供應(yīng)單位對屠宰企業(yè)檢測技術(shù)人員進(jìn)行培訓(xùn)，并跟蹤服務(wù)。要定期對實驗室的操作環(huán)境條件進(jìn)行評估。

六、做好廢棄物無害化處理

要做好檢測后的樣品（血液）及實驗產(chǎn)生的廢棄物（如：一次性采血盛血器、一次性使用真空采血管、一次性PE手套、耗材、器械）的及時收集，并進(jìn)行無害化處置和消毒滅菌處理工作；感染性廢棄物應(yīng)該高壓滅菌之后再轉(zhuǎn)移至指定地點處理。嚴(yán)格做好清潔消毒工作。屠宰場（企業(yè)）和個人不得留存陽性樣品，不得將陽性樣品轉(zhuǎn)送或者轉(zhuǎn)賣給其他單位和個人。

七、完善相應(yīng)檢測技術(shù)支持

非洲豬瘟熒光PCR檢測技術(shù)對操作人員的素質(zhì)能力和對PCR原理的知識儲備是有要求的。否則，在操作和讀取數(shù)據(jù)時都容易出現(xiàn)紕漏。同時，熒光PCR檢測技術(shù)還存在如下的現(xiàn)實問題：檢測環(huán)節(jié)多，質(zhì)量控制點多；操作相對復(fù)雜，反應(yīng)時間較長；試劑組分多，需要自行配制；分區(qū)進(jìn)行，環(huán)境控制要求嚴(yán)格等。檢測的結(jié)果有可能因為血液樣品保存不當(dāng)或溶血、試劑回溫失誤等原因而受到影響。

因此，屠宰場（企業(yè)）做好非洲豬瘟檢測工作，不但要有符合標(biāo)準(zhǔn)的熒光PCR檢測實驗室和規(guī)章制度，還要有懂得PCR原理和操作的技術(shù)人員。同時，采樣、檢測、復(fù)核、監(jiān)督等人員要具備責(zé)任心和實事求是的態(tài)度，要有擔(dān)當(dāng)精神；并要堅持日常清洗消毒制度。